محبوب ترین و متداول ترین کربودی ایمید برای استفاده در کونژوگه مواد بیولوژیکی EDAC می باشد.به صورت محلول در آب و بدون استفاده از حلال های آلی قابل استفاده است. محلول های اضافی و ایزوواره های تشکیل شده مانند فراورده های واکنشی اتصال نتقاطع که هر دو محلول در آب مب باشند باید توسط دیالیز و ژل فیلتراسیون حذف شوند.این ماده به دلیل ناپایداری در برابر آب ،باید در مکانی خشک و دمای -۳۰ᶜ نگهداری گردد و قبل از استفاده از آن باید در دمای اتاق گرم شود.در محلول های آبی هیدرولیز توسط آب صورت می گیرد که واکنش های رقابتی اصلی می باشد. جدا شدن واسطه ی استری فعال، تشکیل ایزوواره می دهد و کربوکسیل احیا می شود.هیدرولیز استر فعال در PH=4.7 با کربودی ایمید EDAC محلول در آب انجام می گردد.حضور کربوکسیلات ها و آمین ها بر روی مولکول های کونژوگه شده با EDC ممکن است به دلیل پلیمریزاسیون خود به خودی باشد زیرا ماده زمینه می تواند با مولکوهایی از نوع خودش نیز واکنش دهد و محصولی جز هدف خواسته شده ایجاد گردد.برای مثال : هنگامی که پپتید با پروتئین حامل توسط EDC کونژوگه می شود.در این مورد پپتید معمولا هم دارای کربوکسیلات و هم آمین می باشد و در نتیجه، علاوه بر جفت شدن با حامل،پلیمریزاسیون پپتیدی رخ می دهد.برای این نوع از کونژوگه های ایمونوژن، پلیمریزه شدن و استفاده از آن مضر نیست زیرا خود پپتید پلیمریزه شده نیز ایمونوژنیک می باشد ولی در رابطه با کراس لینک های دیگر مطلوب است؛ از تشکیل الیگومر جلوگیری نمود.محیط واکنش بهینه برای کربودی ایمید PH<7.5 می باشد تا محصولات بی ضرر و اصلی تشکیل گردند و معمولا طبق دستورالعمل های مخصوص هر کار با محلول HCL اسیدیته ی خواسته شده را ثابت نگه می دارند.( شاپوری،۱۳۸۶)

۲-۷- کونژوگاسیون به روش آمیداسیون
بسیاری از پلی ساکاریدهای باکتریایی در حالت طبیعی فاقد گروه های شیمیایی فعال مانند گروه های آمینو و یا کربوکسیل هستند و به همین دلیل به طور مستقیم نمی توانند به یک حامل پروتئینی به صورت کوالان متصل شوند.در کونژوگاسیون به روش آمیداسیون که یکی از بهترین روش های موجود برای کونژوگه کردن ترکیبات پلی ساکاریدی به پروتئین می باشد ، از آدپیک اسید دی هیدرازید (Spacer) به عنوان یک مولکول فاصله گذار(ADH) 6 کربنه و ۱- اتیل - ۳(۳- دی متیل آمینو – پروپیل ) کربودیمید ( (EDAC در نقش عامل جفت کننده استفاده میشود. EDAC سبب اتصال کوالان مشتق آدپیک هیدرازید – پلی ساکارید به حامل پروتئینی به صورت پیوند آمیدی بین هیدرازید پلی ساکارید با گروه های کربوکسیل پروتئین می شود. ممکن است واکنش های جانبی دیگری بین گروه های آمین اسید آمینه لیزین و کربوکسیل مجاور در یک مولکول پروتئینی و یا در سایر مولکول های پروتئینی به صورت اتصال متقاطع درون مولکولی صورت پذیرد. کونژوگاسیون با روش آمیداسیون سبب میشود که در چندین محل پلی ساکارید به مولکول حامل متصل شده و این حالت را ساختار مشبک می گویند. . برای تبدیل پلی ساکارید ها به آنتی ژن های باید نوع اتصال هاپتن به مولکول حامل از نوع کوالان باشد. سایر پیوند های محکم و یا غیر کوالان در این راستا موثر نمی باشند.چندین روش برای اتصال پلی ساکارید به پروتئین وجود دارد اما سه روش احیای آمیناسیون ، آمیداسیون و اتریفیکاسیون معمولا بهترین این روش ها محسوب می شوند.( شاپوری،۱۳۸۶)
۲-۸- تهیه کونژوگه ایمونوژن هاپتن^۱ – حامل
ماهیت ایمنی تطبیقی به توانایی یک موجود زنده در واکنش به مواد بیگانه و تولید انتی بادی وواکنش متقابل آنها و حفاظت از میزبان می باشد.یک آنتی ژن یا ایمونوژن ماده ای است که ،توانایی تولید این نوع پاسخ ایمنی را دارد و قادر به واکنش با سلول های تحریک شده علیه آن است.سیستم ایمنی دو نوع پاسخ علیه چالش های ایجاد شده توسط مواد بیگانه را دارد: پاسخ ایمنی سلولی ،که توسط لنفوسیت های T ایجاد می شود و پاسخ ایمنی همورال ،که توسط لنفوسیت های B تولید می گردد.نوعی از لنفوسیت های B که پروتئین های ترشحی به نام آنتی بادی میکنند پلاسماسل نام دارند.کونژوگاسیون پلی ساکارید با پروتئین، پلی ساکارید را از فرم آنتی زن غیر وابسته به سلول T به انتی ژن وابسته به سلول T تبدیل می کند،که سبب القای تیترهای بالای پاسخ ایمنی در حیوانات می شود. آنتی ژن ها معمولا ماکرومولکول هایی هستند که شامل مکان های آنتی ژنی تشخیصی یا اپی توپهای سازمان دهی شده می باشند که با اجزائ سیستم ایمنی واکنش متفابل دارند.آنتی زن ها ممکن است مولکول هایی با ترکیبات آلی مانند : پروتئین ،لیپو پروتئین، RNA،DNA ، پلی ساکاریدها و یا قسنت هایی از ساختارهای سلولی باکتریایی،قارچ یا ویروس باشند. مولکول های کوچکی مانند پپتید های کوتاه که اغلب نمی توانند به تنهایی باعث ایجاد پاسخ ایمنی گردند را هاپتن می گویند.این مولکول ها آنتی ژن های ناقصی هستند که به صورت ترکیب با مولکول حامل مناسب می توانند به عنوان ایمونوژن عمل کند.حامل ها معمولا مولکول هایی با وزن مولکولی بالا هستند. مولکول های هاپتن حاوی آلدهید با وزن مولکول حامل توسط احیای آمیناسیون متصل گردند.
۲-۹- پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیک
متداول ترین حامل های مورد استفاده مولکول های بزرگی هستند که ایمنی زایی بالایی ایجاد میکنند و با مولکول های هاپتن پیوند کوالانسی ایجاد میکنند.یکی از مناسب ترین این ها پروتئین ها می باشند ام حامل های دیگری مانند لیپید دو لایه ( لیپوزوم) ،پلیمرهای طبیعی یا مصنوعی ( دکستران، آگارز ) یا مولکول های طراحی شده نیز وجود دارند.اولین مولکول های حامل برای کونژوگاسیون ، پروتئین های ایمونوژن بودند. حامل های پروتوینی به فراوانی حل می شوند و دارای گروه عاملی فراوانی هستند که می توانند کونژوگاسیون با مولکول های هاپتن را تسهیل کنند.متداولترین حامل های پروتوینی که امروزه از آنها استفاده می گردد به شرح زیر می باشند:
KLH ، سرم آلبومین گاوی ( BSA ) ، سرم آلبومین گاوی آمینواتیل دار، تیرو گلبولین، اوآلبومین ( OVA ) و انواع توکسوئیدهای پروتئینی مانند توکسین ها یا توکسین دیفتری ،توکسین یا توکسءید کزاز، موتانت های غیر توکسیک دیفتری CRM-197 ، اگزوتوکسین A سودوموناس ،پنومولیزین استرپتوکوکوس پنومونیه، فیلامنت هماگلوتینین ( FHA ) بوردتلا پرتوسیس، پیلی یا پیلین نایسریا گونوره آ، پیلی یا پیلین نایسریا مننژیتیدیس، OMP نایسریا گونوره آ، پپتیداز CoA استرپتوکوکوس . پروتئین های سطحی مورکسلا کاتارالیس.دیگر پروتئین هایی که گاهی اوقات استفاده می شوند: میوگلوبین، سرم آلبومین خرگوش،مولکول های ایمونوگلوبولین، ( به ویژه IgG ) از سرم موشی یا گاوی ، توبرکولین خالص شده.
۲-۱۰- ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه
آلومینیوم فسفات، آلومینیوم هیدروکساید، مونوفسفوریل لیپید A، ۳- دی آسیل مونوقسقوریل لیپید A، QS₂₁ همچنین انواع پاک کنندها : ( تریتون X100 ،زوئترجنت ^۱ و دزوکسیکولات ) در ترکیب با ترکیبات آلومینیومی.در کل پاسخ آنتی بادی ها در حضور کونژوگه ی همراه ادجوانت در واکسن ،افزایش می یابد.
۲-۱۱- سنجش فعالیت باکتری کشی
حساسیت میکروارگانیسم ها به عوامل ضد میکروبی اغلب در آزمایشگاه به وسیله اندازه گیری فعالیت ممانعت از رشد آن ها سنجیده می شود. این سنجش ها، آزمون هایی هستند که همیشه اطلاعات کافی برای تعیین روش درمانی مناسب مبتلایان به عفونت های خاصی مثل اندوکاردیت نمی دهند. علاوه بر آن، عوامل ضد میکروبی خاصی مثل β –Lactam ها، که دارای فعالیت باکتریسیدالی نیز می باشند،نمی توانند برای تمامی ارگانبیسم ها کشندگی داشته باشند. بنابراین، نیاز به روش های آزمایشگاهی جدیدی که بتواند فعالیت باکتری کشی یک عامل ضد میکروبی را تعیین کند، می باشد.
آزمون Serum Bactericidal Assay (SBA)، روش اصلاح شده Broth Dilution می باشد، که فعالیت ضد باکتری سرم یک بیمار را در هنگام مواجهه با باکتری پاتوژن را بررسی می کند. این تست، یکی از تست هایی است که در آزمایشگاه میکروبیولوژی پزشکی در ارتباط با پاتوژن، عامل ضد میکروبی و بیمار می باشد.با این وجود، استفاده از چنینتستی برای بررسی فعالیت باکتری کشی در سرم بیمار به مذت ۴٠ انجام می گیرد وسوالاتی برای نحوه انجام آن، تفسیر و نتایج آن ایجاد شده است.
در میان روش های آزمایشگاهی بررسی فعالیت باکتری کشی سرم بیمار، هیچ کدام به اندازه SBA موثر نبودند. سابقه آزمون های برآورد فعالیت ضد باکتری خون به دوره های قبل از عصر آنتی بیوتیک می رسد. با این وجود، Schlichter و Mac Lean را بنیانگذار روش SBA می دانند. آن ها بر روی خاصیت بازدارندگی رشد سرم مطالعه نمودند، اما نتوانستند ملاک درستی خصوصیت باکتری کشی تعریف کنند. در واقع، Fisher بود که در نهایت روش Schlichter را با پاساژ دادن ل.له هایی که رشد قابل مشاهده در آن ها دیده نمی شد، توانست اصلاح کند. اگر چه، Fisher اذعان داشت، نیاز به تعیین غلظت باکتری کشی سرم می باشد، اما هیچ روش قابل قبولی در دنیا برای Microdilution و Macrodilution در انجام SBA وجود ندارد. شکی نیست که بررسی های مختلف SBA، این تکنیک را از نظر کلینیکی، غیرکاربردی دانسته و بر وجود استانداردسازی این روش تاکید می کند. این تست در هر جایی می تواند انجام گیرد، اما از یک آزمایشگاه به آزمایشگاه دیگر، نحوه اجرای این تکنیک، به دلیل بررسی متغیر های متنوع، متفاوت خواهد بود.
جهت اهداف کلینیکی، نسخه های متعدد و تغییر در نحوه اجرای تست می تواند تعداد زیادی از متغیر ها را از مطالعات حذف کند. بنابراین، کمیته ملی استاندارد های آزمایشگاه های پزشکی آمریکا دستور العمل هایی را برای انجام SBA و مطالعات بررسی باکتری کشی به چاپ رسانده است. این دستور العمل ها ابعاد مختلف SBA و پژوهش های باکتری کشی را بیان کرده و بر لزوم استانداردسازی این روش ها تاکید می کند. پس از استانداردسازی، امکان انجام مطالعات پیچیده کلینیکی فراهم می شود.
با وجود این که در In Vitro بررسی خاصیت کشندگی یک عامل ضد میکروبی بسیار جذاب به نظر می رسد، اما عواملی وجود دارند در این بررسی های آزمایشگاهی می توانند تداخل ایجاد کنند. این فاکتور ها هم بیولوژیک، و هم تکنیکی هستند.
از عوامل بیولوژیک می توان، وجود باکتری های مقاوم، اثر متناقض (Paradoxal Effect)، تولرانس باکتری در برابر ماده ضد میکروبی و انتشار عامل مقاومت را نام برد.
از عوامل تکنیکی می توان، فاز رشد کشت تلقیح شده، مقدار کشت، عدم تماس کافی بین دارو و میکروارگانیسم، حجم نهایی باکتری پس از فعالیت باکتری کشی و انتخاب محیط کشت مناسب را نام برد.
مراحل انجام روش SBA به ترتیب تهیه سرم بیمار، تهیه رقت و ساخت محیط کشت، تلقیح سرم بیمار در محیط کشت ، انکوباسیون، تعیین میزان باکتری کشی سرم، کنترل کیفی می باشد.
از این روش می توان در جهت تشخیص، هم چنین بررسی میزان ایمنی زایی واکسن ها در عفونت های Streptococccus pneumonia، Vibrio cholera، Haemophilus influenza ،Neissria meningitidis، Brucella abotus و … پرداخت.
فصل سوم
مواد
و
روش ها
۳-۱-۱ مواد و وسایل لازم
۱- سویه استاندارد هموفیلوس آنفلوآنزا تیپ b
۲- انکوباتور
۳- هود میکروبی- هود کشت استریل
۴- اتوکلاو
۵- پمپ و دستگاه تقسیم
۶- سانتریفوژ یخچالدار(HeHich)
۷- لام
۸- بن ماری شیکردار
۹- یخچال ۴۰C
۱۰- فریزر
۱۱- لوله آزمایش
۱۲- ارلن
۱۳- مزور
۱۴- ظروف ۱ لیتری سانتریفوژ
۱۵- بشر
۱۶- سمپلرو سرسمپلر
۱۷- پیپت
۱۸- پیپت پاستور
۱۹- پلیت شیشه ای و پلاستیکی
۲۰- سرنگ ۵ cc و cc 2
۲۱- دستکش لاتکس
۲۲- ماسک
۲۳- پارافیلم
۲۴- چسب اتوکلاو
۲۵- فویل آلومینیومی
۲۶- یخ
۲۷- لوله شیشه ای سانتریفوژ
۲۸- کیسه دیالیز با Cut off: 10.000