۲-۶-۱۰-۳ رنگ آمیزی ژل SDS-PAGE
به منظور مشاهده باندهای پروتئینی، لازم است ژل را رنگ آمیزی نمود. روش های مختلفی برای رنگ آمیزی ژل های SDS-PAGE وجود دارد که متداولترین آنها روش رنگ آمیزی با کوماسی بلو و یا نیترات نقره می باشد. عموماً از روش کوماسی بلو استفاده می شود زیرا که یک روش سریع و ارزان بوده و ثبات رنگ طولانی است.
استفاده از کوماسی بلو
مواد لازم
- رنگ کوماسی بلو
- الکل ۹۶% (برای رنگ بری)
- آب مقطر
روش انجام رنگ آمیزی
-
- ژل را در داخل ظرف رنگ آمیزی قرار می دهیم و مقداری رنگ به آن اضافه و به مدت۱۰ دقیقه بر روی شیکر می گذاریم.
-
- رنگ را خالی کرده و ژل را داخل محلول رنگ بر (آب مقطر حاوی اتانول) بر روی شیکر قرار می دهیم تا زمینه ژل شفاف شده و باندهای پروتئینی آبی رنگ نمایان شوند.
۲-۶-۱۰-۴ رنگ آمیزی ژل به روش نیترات نقره (پیوست ۷)
-
- قرار دادن ژل در بافر فیکساسیون به مدت ۲ ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر.
-
- دور ریختن بافر فیکساسیون و اضافه نمودن بافر شستشو سه بار و هر بار به مدت ۲۰ دقیقه.
-
- اضافه کردن بافر sensitizing به مدت ۲ دقیقه.
-
- دور ریختن بافر sensitizing و شستشو با آب مقطر سه بار و هر بار ۵ دقیقه.
-
- اضافه کردن بافر رنگزا به مدت ۲۰ دقیقه در دمای اتاق بر روی شیکر.
-
- شستشوی ژل در آب مقطر و اضافه کردن بافرdeveloping تا ظهور باندهای پروتئینی.
-
- اضافه کردن بافر متوقف کننده به مدت ۱۵ دقیقه.
-
- شستشوی ژل در آب مقطر.
۲-۷ روش های اختصاصی
۲-۷-۱ سنتز ژن gcsf
توالی cDNA کد کننده پروتئین GCSF به طول bp 615 از بانک ژنومی (شماره ۱۷۲۲۱۹.۱) استخراج و به منظور سنتز به یکی از شرکتهای فعال در این زمینه سفارش داده شد. این توالی به منظور بیان در سلولهای مخمری از نظر کدونهای مورد استفاده در سنتز پروتئین، بهینه سازی شده و پس از بررسی های نهایی از نظر جایگاه های برش آنزیم های محدودالأثر، ساخته شده و در وکتور کلونینگ pGH کلون گردید. در دو انتهای این ژن، دو جایگاه برش آنزیمی برای آنزیمهای محدودالأثر HpaI و BamHI در نظر گرفته شد تا برای جدا نمودن این قطعه و کلون کردن آن در وکتور بیانی مخمر استفاده شوند. لازم به ذکر است که جایگاه برش این آنزیم ها بر روی قطعه ژنی سنتز شده، وکتور pGH و وکتور بیانی هانسونلا وجود ندارد.
۲-۷-۱-۱ PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf
۲-۷-۱-۱-۱ طراحی پرایمرهای اختصاصی ژن gcsf
به منظور انجام PCR بر روی ژن gcsf در وکتورهای بدست آمده در مراحل مختلف، پرایمرهای اختصاصی این ژن با بهره گرفتن از برنامه genrunnr سنتز گردید (جدول ۲-۲).
| پرایمر F | ‘gtagatcttgcggatccccc-3-’5 |
| پرایمر R | ‘gtagatcttggtctccagcttgc-3-’5 |
جدول ۲-۲: توالی پرایمرهای ژن gcsf
۲-۷-۱-۱-۲ بهینه سازی واکنش PCR
با انجام گرادیان PCR بهترین دمای اتصال پرایمرها به منظور بهینه سازی شرایط این واکنش مشخص گردید. این واکنش بر اساس مواد ذکر شده در جدول۲-۳ و بر طبق برنامه مندرج در جدول ۲-۴ انجام شد.
| مواد |
