دستگاههای مورد استفاده در این تحقیق به صورت زیر میباشد:
انکوباتور شیکردار مدل INFORS FG, Eittergasse 27 , CH-4103 Bottmingen
دستگاه انکوباتور مدل Memmert
هود لامینار مدل BEASAT-BSC126
دستگاه اسپکتوفوتومتر مدل Varian cary 50 UV- visible
آون Binder
ترازوهای معمولی و دیجیتال مدل Mehlern Toledo
بنماری Memmert
ورتکس
اسپین
هیتر Heidolph, (Heater stirrer)
الکتروفورز
PCR ترموسایکلر مدل Hielscher
Gel doc مدل Cyngene
PH متر
سانتریفیوژ مدل NAPCO-2028R
وسایل دیگر آزمایشگاهی که در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفتند شامل موارد زیر می باشند:
میکروتیوپ، فالکون، سمپلر، سر سمپلر،پتری دیش، ارلن، بشر، استوانه مدرج، لوله آزمایش، شیشههای درب آبی، قاشقک، لوپ،مگنت
استخراج کوتین
در اولین مرحله شناسایی گونه های تولیدکننده آنزیم کوتیناز، نیاز به تهیه سوبسترای کوتین میباشد. با توجه به عدم در دسترس بودن کوتین در بازار لازم بود که آن را از میوه ها تهیه کنیم. به این منظور میوههای سیب قرمز، سیب زرد، گوجه فرنگی و خیارسبز از سوپرمارکت خریداری شدند. میوه ها شستوشو داده و وزن گردیدند آنگاه پوست میوه ها را جدا کرده و بعد از وزن کردن پوست میوه ها، آنها را در بافر اگزالات (۲گرم اگزالیک اسید، ۸گرم آمونیوم اگزالات، ۵۰۰ میلی لیتر آب) به مدت ۴ ساعت جوشانده شد تا پالپها کاملا جدا شوند پوست میوه ها را فیلترکرده و با آب مقطر شستوشو داده و وزن کرده و سپس پوستها را در آون ۴۰ درجه سانتیگراد خشک کرده و آسیاب میکنیم. پودر بدست آمده را در محلول کلرفرم متانول به نسبت۲ به ۱ (۶۰ میلیلیترکلروفرم، ۳۰ میلیلیتر متانول) میریزیم و به مدت ۱۲ تا ۲۴ ساعت روی شیکر قرار میدهیم و سپس به محلول بدستآمده آب اضافه کرده و در دستگاه سانتریفیوژ با دور ۱۲۰۰۰ و به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شدند سه فاز در این حالت تشکیل می شود که فازهای رویی را دور ریخته سپس فاز زیری را جدا میکنیم. فاز زیری را درون پتری ریخته و پتری را در آون ۸۰ درجه سانتیگراد خشک میکنیم. پودر بدست آمده همان کوتین است [۵۶].
نمونه برداری
نمونههای قارچی و باکتریایی از پوست میوه و خاک باغچه (مرطوب و از برگهای در حال تجزیه) نمونه معمولی خاک سطح برگ یا میوههای مشکوک به آلودگی تودهی باکتری ، ورمیکمپوست جمعآوری شد.
غربالگری و جداسازی گونه های تولیدکننده آنزیم کوتیناز
به منظور غربالگری و جداسازی سریع نمونههای تولید کننده آنزیم کوتیناز از محیط کشتی باید استفاده گردد که کوتین تنها منبع کربن آن برای استفاده میکروارگانیزمها باشد و تنها میکروارگانیزمهایی در این محیط رشد کنند که قادر به تجزیه کوتین باشند.
این محیط کشت حاوی ترکیبات زیر است:
۰۳/۰ گرم سدیمکلرید، ۰۳/۰ گرم آهننیترات، ۰۳/۰گرم پتاسیمکلرید، ۵/۰ گرم آمونیومکلرید، ۰۱/۰ گرم آهنسولفات، ۰۶/۰ گرم پتاسیمدیهیدروژن فسفات، ۰۲/۰ گرم منیزیمسولفات. این مواد را در ۱۰۰ میلی لیترآب حل کرده سپس pH محیط را به ۲/۷ رسانده و به آن ۴/۰ گرم کوتین اضافه کرده و اتوکلاو شد[۵۷].
بدین منظور در ۹ فالکون در هر کدام ۱۰ میلی لیتر از محیط کشت تهیه شده در مرحله قبل ریخته و به صورت زیر کشت میدهیم. در یکی از محیط کشتها چیزی کشت ندادیم و به عنوان نمونه شاهد قرار دادیم، در محیط کشت شماره یک ۱/۰ گرم از خاک باغچه ریختیم، درمحیط کشت شماره دو ۱/۰گرم خاک کمپوست، در محیط کشت شماره سه ۱/۰ گرم خاک باغچه ( پای درخت توت)، در محیط کشت شماره چهار ۱۸/۰ گرم از ناحیهی آلوده پوست سیب قرمز، درمحیط کشت شماره پنج ۳۵/۰گرم از ناحیهی آلودهی پوست سیبزرد، در محیط کشت شماره شش هم۶۴/۰گرم پوست گوجه آلوده، در محیط کشت هفت ۵۹/۰ گرم از پوست آلوده به میکروب سیب زرد و درمحیط کشت شماره هشت ۱۴/۰گرم از پوست آلودهی سیب زرد کشت دادیم. سپس نمونهها به مدت ۳ تا ۵ روز در شیکرانکوباتور با دمای ۳۰ درجه وrpm 150 قرار داده شد [۸۳].
بعد از رشد کردن اولیه نمونهها نیاز به غربالگری آنها در روی محیط کشت جامد میباشد. محیط کشت جامد حاوی ترکیبات زیر است:
۰۳/۰ گرم سدیمکلرید، ۰۳/۰ گرم آهننیترات، ۰۳/۰ گرم پتاسیمکلرید، ۵/۰ گرم آمونیومکلرید، ۰۱/۰ گرم آهنسولفات، ۰۶/۰ گرم پتاسیمدیهیدروژنفسفات، ۰۲/۰گرم منیزیمسولفات و ۵/۳ گرم آگار را در ۱۰۰ میلی لیترآب حل کردیم. سپس pH محیط به ۲/۷ رسانده شد، به آن ۴/۰ گرم کوتین اضافه کردیم و محیط حاصل اتوکلاو گردید و بین پلیت ها تقسیم گردید. ۲۰میکرولیتر از هر محیط کشت مایع را در زیر هود در هر پلیت تلقیح کرده و بعد به انکوباتور ۳۰ درجه منتقل گردیده شد.
به دلیل اینکه نمونههای کشت داده شده و رشد کرده خالص نبودند، برای تخلیص نمونهها، کلنیهای رشد کرده به پتریهای دیگر حاوی محیط کشت انتقال دادیم. بعد از رشد مناسب سویهها، پلیتهای موردنظر تا زمان ساخت اسلنت در یخچال ۴ درجه نگهداری می شود. سپس هر سویه را به یک slant برای نگهداری به یک محیط کشت مایع برای سنجش فعالیت کوتیناز انتقال دادیم. بعد از رشد نمونهها یک تک کلنی را برداشته و در محیط کشت مایع درون فالکون تلقیح داده شد و به مدت ۳ تا ۴ روز درون انکوباتور شیکردار با دور ۱۵۰ دور در دقیقه و دمای ۳۰ درجه سانتیگراد تیمار گردید. ۴ گرم نوترینت اگار را در ۲۰۰ میلی لیتر اب حل میکنیم اتوکلاو میکنیم سپس بین پتریها تقسیم میکنیم و سپس باکتری ها را انتقال میدهیم. از این پتریها نمونهها را به اسلند انتقال میدهیم.
تهیه slant از سویههای جدا شده
یک کلنی خاص از سویههای جداشده را بر روی محیط اسلنت انتقال داده و بعد از انکوباسیون اسلنتها به مدت ۴۸ ساعت، آنها در یخچال و دمای ۴ درجه نگهداری میشوند. اسلنتها را هم به مدت ۴۸ ساعت (تا زمانی که رشد کنند) در انکوباتور قرار دادیم. ۱۵۰ میلیلیتر آب را و ۳ گرم نوترینت اگار را در بشر با حرارت ملایم حل میکنیم و در هر لوله ۱۵ میلیلیتر میریزیم بعد پنبه میگذاریم و اتوکلاو میکنیم بعد به صورت کج میگذاریم تا ببندد و بعد از بستن و سرد شدن و یک کلنی خاص از سویههای جداشده را بر روی محیط اسلنت انتقال داده و بعد از انکوباسیون اسلنتها به مدت ۴۸ ساعت، آنها در یخچال و دمای ۴ درجه نگهداری میشوند. Slant ها را هم به مدت ۴۸ ساعت (تا زمانی که رشد کنند) در انکوباتور قرار دادیم. (slant به مدت یک ماه قابل نگهداری است).
نگهداری طولانی مدت سویهها
به منظور نگهداری طولانی مدت سویهها، ابتدا محیط کشت مایع نوترینت براس یا LB تهیه نموده و سویهها را در آن تلقیح کرده و در شیکر انکوباتور به مدت ۲۴ ساعت به منظور رشد بهینه قرار داده می شود سپس ۷۶۰ میکرولیتر از محیط کشت حاوی باکتری و ۷۶۰ میکرولیتراز گلیسرول ۴۰% به میکروتیوبهای ۵/۱ میلی لیتری انتقال داده و به مدت چند دقیقه به آرامی تکان داده می شود و در فریزر۸۰- برای طولانی مدت نگهداری می شود.
تهیه گلیسرول
۲۰۰ میکرولیتر گلیسرول و ۸۰۰ میکرولیتر آب مقطر را بهم افزوده و گلیسرول ۲۰% تهیه می شود.
تهیه محیط کشتLB
۵ گرم y(مخمر)
۱۰ گرم T(تریپتون)
۵ گرم nacl
این سه ماده را به هم اضافه نموده و آب مقطر به حجم یک لیتر اضافه می شود و اتوکلاو می شود.
محیط کشت LB را بعد از اتوکلاو در هر فالکون ۵ میلیلیتر میریزیم و نمونه را به آن انتقال میدهیم. سپس به مدت ۱۲ تا ۲۴ ساعت در انکوباتور میگذاریم. بعد فالکونهای حاوی محیط کشت LB و نمونه را با rpm 4000 و به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ میکنیم.
۲ میلیلیتر از محلول رویی را بیرون میریزیم و ۳ میلیلیتر باقی مانده را پیپتاژ میکنیم. بعد درون هر ویال ۶۰۰ میکرولیتر از محلول پیپتاژ شده و ۴۰۰ میکرولیتر محلول گلیسرول ۵۰ درصد میریزیم و به مدت چند دقیقه به آرامی تکان داده می شود بعد در یخچال ۸۰- درجه نگهداری میکنیم.
Assay آنزیمی
به منظور assay یا سنجش فعالیت آنزیمی از تکنیک طیفسنجی یا روش اسپکتروفتومتری استفاده می شود. سیستم اسپکتروفتومتر نور ثابت با طول موج دلخواه به وجود میآورد. پس از عبور نور از محلول، نور باقیمانده به قسمت نورسنجی یا فوتومتر میرود. فوتومتر از نوع فتومولتی پلایر تیوب، فوتو دیود و… نور را به سیگنال الکتریکی تبدیل می کند. سپس سیگنالهای دریافت شده اندازه گیری و پردازش میشوند تا کمیت مورد نظر به دست آید. خروجی اسپکتروفوتومتر همیشه نموداری از شدت نور نسبت به طول موج است. دادههایی که برای تولید نمودار گردآوری شده، در جدولی از شدت نور و طول موج ذخیره می شود. مقدار گراف بیان کننده مقدار عبور یا مقدار جذب است. اسپکتروفوتومترهای امروزی دیجیتالی بوده و به وسیله میکروپروسور کنترل میشوند. از این دستگاه برای اندازه گیری غلظت ماده رنگی محلولها، به طور مثال اندازه گیری قند، اسید اوریک، کلسترول، آنزیم های مختلف و… استفاده می شود. این دستگاه قابلیت اندازه گیری نمونههای فوق العاده کوچک را داشته لذا از آن برای تجزیه و تحلیل عناصر مولکول های RNA، استفاده می شود.
