مورفین
پتیدین
جنتامایسین
ست جراحی
PBS
فرمالین ۱۰%
اتانول ۷۰%
لایزینگ بافر
سلول‌های فیبروبلاست
FBS
تریپسین
محیط کشت DMEM
XTT
PMS
پنیسیلین استرپتومایسین
رنگ تریپان بلو
لام نئوبار
بیوپسی پانچر
هود لامینار
انکوباتور CO₂
میکروسکوپ اینورت
پیپت پاستور ۱۰ ml
فلاسک کشت ۲۵, ۷۵ cm²
فالکن ۱۵, ۵۰ ml
تیوب‌های استریل ۲ ml
پلیت ۹۶ خانه
الایزا ریدر
پیپتور
ورتکس
سمپلر و سر سمپلر
۳-۲٫ طرز تهیه‌ی محلول‌ها و معرف‌های بکار رفته
۳-۲-۱٫ محیط کشت DMEM
محیط کشت DMEM با گلوکز بالا و غنی شده با L-glutamate به صورت آماده از شرکت آریوژن خریداری می‌گردید. بسته‌های خریداری شده به حجم ۵۰۰ ml بود و به منظور جلوگیری از آلودگی، در فالکون‌های ۵۰ ml تقسیم شده و در یخچال نگهداری شدند.
FBS
در این پژوهش از سرم جنین گاو استفاده شد. نقش سرم در محیط کشت تأمین فاکتور‌های رشد هورمون‌ها و برخی اسید آمینه‌ها و پیش‌ساز‌های اسید نوکلئیک و اسید چرب می‌باشد. به منظور غیر فعال کردن کمپلمان موجود در آن، در بن ماری در دمای ۵۶ درجه سانتی‌گراد به مدت ۳۰ دقیقه حرارت داده شد. پس از غیر فعال کردن کمپلمان‌ها، FBS در لوله‌های فالکون استریل تقسیم و در فریزر ۲۰- درجه نگهداری شد. میزان مصرف آن در محیط کشت DMEM 10% می‌باشد.
۳-۲-۲٫ بافر PBS
یک عدد قرص PBS در ۲۰۰ ml آب مقطر دو بار تقطیر حل شد. سپس با بهره گرفتن از فیلتر استریل شده و در لوله‌های فالکون ۵۰ ml استریل، الیکوت و در ۲۰- نگهداری شد.
۳-۳٫ کشت سلول‌های فیبروبلاست
سلول‌های فیبروبلاست از بانک سلولی آزمایشگاه کشت سلولی دانشگاه تربیت مدرس تهیه شده و در شرایطی استریل به آزمایشگاه مربوطه منتقل شدند. به منظور آماده‌سازی محیط کشت فیبروبلاست، به محیط کشت DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco) FBS و پنسیلین- استرپتومایسین در شرایط کاملاً استریل مخلوط و در یخچال نگهداری شد. هر بار پیش از مصرف، دمای آن به کمک حمام آب گرم به ۳۷ درجه سانتی‌گراد رسانیده می‌شد. محیط کشت DMEM مشتق از MEM می‌باشد که حاوی حداقل مواد لازم برای رشد سلول (اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها و نمک‌ها) می‌باشد. بافر PBS به صورت استریل و از اختلاط KCl،KH₂PO₂ ، NaCl، Na₂HPO₄ تهیه و به عنوان محلول شستشو قبل از جداسازی سلول‌ها و همچنین به عنوان رقیق کننده تریپسین مورد استفاده قرار گرفت. این بافر هم در یخچال نگهداری و قبل از مصرف به دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد رسانیده شد.

سلول‌های فیبروبلاست تحت شرایط استریل در فلاسک T-75 و در انکوباتور با دمای ۳۷ درجه و %۵ CO₂و رطوبت ۹۵% کشت داده شدند. سلول‌ها هر روز برای بررسی میزان رشد و تکثیر و همچنین آلودگی احتمالی یا تخریب سلولی زیر میکروسکوپ معکوس مورد مشاهده قرار گرفتند و محیط کشت آنها به هنگام لزوم (مثلاً کاهش pH محیط و تغییر رنگ آن از قرمز به زرد) تعویض گردید. هنگامی‌که سلول‌ها تقریباً ۹۰% سطح فلاسک را می‌پوشاندند، پاساژ سلولی انجام می‌گرفت و پس از پاساژ دهم، از سلول‌ها برای انجام مطالعات سیتوتوکسیسیتی استفاده شد. برای پاساژ، مایع رویی فلاسک دور ریخته شد و برای اینکه محیط کشت به طور کامل خارج شود محلول استریل PBS اضافه گردیده و تخلیه شد. در این مرحله به فلاسک عاری از محیط کشت، تریپسین آماده اضافه شد و فلاسک به مدت یک دقیقه در انکوباتور نگهداری شد تا سلول‌های چسبیده به کف جدا شده و به صورت معلق درآیند. سپس محتویات فلاسک به لوله‌های فالکن استریل منتقل شدند تا با دور RPM 1500‌ به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ شوند. پس از اتمام سانتریفیوژ، مایع رویی فالکن‌ها در زیر هود تخلیه شده و مجدداً محیط کشت اضافه شد و با عمل پیپتاژ کلمپ‌های سلولی از هم باز شدند. در این مرحله سلول‌های موجود در سوسپانسیون بدست آمده با بهره گرفتن از رنگ‌آمیزی تریپان بلو و لام نئوبار با کمک میکروسکوپ معکوس، شمارش شدند.
۳-۴٫ آماده‌سازی غلظت‌های مختلف لیپو پلی ساکارید
در این تحقیق از LPS سالمونلا انتریکا که از شرکت سیگما خریداری شده بود برای تیمار فیبروبلاست‌ها استفاده شد. به منظور جلوگیری از آلودگی، محلول استوک LPS به میزان ۲/۰ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در آب دو بار تقطیر استریل تهیه شده و در میکروتیوب‌های استریل در یخچال نگهداری شدند. جهت رقیق‌سازی LPS و بدست آوردن غلظت‌های مختلف از محیط کشت فیبروبلاست به عنوان رقیق کننده استفاده گردید. غلظت‌ها به صورت نیم لگاریتمی‌ و در محدوده‌ی ۱۰۰، ۶/۳۱، ۱۰، ۱۶/۳، ۱ میکرو گرم تا ۳۱۶، ۱۰۰، ۶/۳۱، ۱۰، ۱۶/۳ نانوگرم تهیه شدند. با توجه به اینکه LPS تمایل زیادی به چسبیدن به دیواره‌ی ظرف دارد قبل از هر بار استفاده عمل ورتکس انجام می‌گردید.
۳-۵٫ تیمار لیپو پلی ساکاریدی فیبروبلاست‌ها
پس از تهیه‌ی غلظت‌های مختلف LPS، محتویات هر میکروتیوب به ردیف‌های traff 12 خانه منتقل شدند. برای تیمار، سلول‌ها به دو گروه تقسیم‌بندی شدند. گروه اول گروهی بود که تیمار آنها بدون انکوباسیون ۲۴ ساعته بود یعنی دقیقاً همان روزی که سلول‌ها در پلیت کشت داده شدند بدون هیچ وقفه‌ای تیمار هم برای آنها انجام گرفت. گروه دوم گروهی بود که سلول‌هایی که از ۲۴ ساعت قبل در پلیت‌های ۹۶ خانه در انکوباتور کشت داده شده بودند توسط LPS تیمار گردیدند. به ازای هر ۵۰ ماکرولیتر سلول، ۵۰ ماکرو لیتر هم از غلظت‌های مختلف LPSدر هر ردیف اثر داده شد. سپس پلیت‌های تیمار داده شده به مدت ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت در انکوباتور نگهداری شدند تا برای رنگ‌آمیزی XTT آماده شوند.
۳-۶٫ رنگ‌آمیزی XTT
۲۴ ساعت قبل از انجام این رنگ‌آمیزی، سلول‌ها در پلیت ۹۶ خانه کشت داده شدند. بطوری که به هر چاهک ۱۰۰ ماکرولیتر از محیط کشت اضافه گردید. هر تست یک بلانک داشت که فقط حاوی محیط کشت بود. برای شروع کار، معرف XTT و معرف فعال کننده PMS سریعاً قبل از آغاز آزمایش به دمای ۳۷ درجه رسانیده شد. برای آماده‌سازی محلول واکنشگر کافی برای یک پلیت ۹۶ خانه ۱۲۰ ماکرولیتر PMS و ۶ میلی‌لیتر XTT نیاز بود. بعد از اضافه کردن محلول واکنشگر به هر چاهک، پلیت مربوطه به مدت ۲ و ۴ ساعت در انکوباتور نگهداری شد. سپس میزان جذب نوری نمونه‌ها توسط الایزا ریدر (ELISA-reader) با طول موج ۴۵۰-۵۰۰ نانومتر سنجیده شد.
حساسیت روش XTT به دلیل حضور یک عامل فعال کننده به نام PMS (N- متیل دی بنزوپیرازین متیل سولفات) که نوعی حامل الکترون واسطه است تقویت می‌شود. ترکیب PMS به احیای XTT و تشکیل مشتقات فورمازان کمک می‌کند. روش XTT به دلیل عدم استفاده از ایزوتوپ‌های رادیواکتیو ایمن‌تر از MTT می‌باشد. با توجه به اینکه جذب رنگ در این روش متناسب با تعداد سلول‌ها در هر چاهک است دقیق‌تر از MTT می‌باشد. این روش طی یک مرحله در دو ساعت جواب می‌دهد. در این روش به غیر از دو معرف XTT و PMS هیچ معرف اضافی دیگر و شستشوی سلولی مورد نیاز نیست.
شکل ۳-۱٫ احیای کلرومتریک XTT با آنزیم‌های سلولی
۳-۷٫ رنگ‌آمیزی تریپان بلو
این آزمایش برآوردی تقریبی از viability سلول‌ها بود که بر اساس عدم جذب رنگ تریپان بلو توسط سلول‌های زنده استوار می‌باشد. در حالی که سلول‌های مرده نسبت به این رنگ نفوذپذیر بودند. این رنگ تمایل زیادی به پروتئین‌های موجود در سرم دارد به همین دلیل قبل از رنگ‌آمیزی سلول‌ها به خوبی با PBS شسته داده شدند تا پروتئین‌های باقی مانده سرم کاملاً از محیط خارج شوند.