دیفیوژن صورت پذیرفت. از انتروکوکوس فکالیس ATCC29212 نیز به عنوان کنترل منفی استفاده گردید ۸۲
شکل ‏۴‑۱۱: مقاومت آنتی بیوتیکی انواع نمونه ها به جنتامایسین ۸۴
شکل ۴‑۱۲: مقاومت آنتی بیوتیکی انواع نمونه ها به استرپتومایسین ۸۵
فهرست جداول
جدول ‏۴‑۱: پرایمرهای استفاده شده در این مطالعه برای پیدا کردن سویه‌های مقاوم به آمینوگلیکوزید ۶۹

جدول ‏۴‑۱: نتایج مربوط به جنسیت نمونه های مثبت بدست آمده. مشخص شده است. ۸۰
جدول ‏۴‑۲: نتایج بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین برای انتروکوکوس فکالیس ۸۳
جدول ‏۴‑۳: نتایج بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین برای انتروکوکوس فاسیوم ۸۳
چکیده
زمینه وهدف: انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم با توانمندی بالا در ایجاد بیماری­های عفونی مانند اندوکاردیت، عفونت ادراری و مننژیت هستند. توانمندی بالای آنها برای کسب ژن­های مقاومت به آنتی بیوتیک، درمان آنها را با مشکلات جدید مواجه کرده است. هدف از این مطالعه بررسی مقاومت افزایشی انتروکوکوس فکالیس و فاسیوم به آنتی بیوتیک های آمینوگلیکوزیدی بوده است.
مواد و روش ها: ۱۰۰ نمونه انتروکوک از آزمایشگاه بالینی نور تهران، پس از جمع آوری با بهره گرفتن از تست های بیوشیمیایی معمول، شناسایی شدند. برای سویه‌های جدا شده تست تعیین حساسیت گونه­ ها به آنتی بیوتیک­های آمینوگلیکوزیدی با غلظت­های افزایش یافته جنتامایسین ۱۲۰ میکروگرم و استرپتومایسین ۳۰۰ میکروگرم و همین طور دیگر آنتی بیوتیک­های آمینوگلیکوزیدی با بهره گرفتن از روش دیسک دیفیوژن انجام شد. در نهایت به منظور شناسایی مولکولی مقاومت، حضور ۶ ژن عامل ایجاد مقاومت با بهره گرفتن از روش Multiplex PCR بررسی شدند.
نتایج: از ۱۰۰ ایزوله، ۸۴% انتروکوکوس فکالیس و ۱۶% انتروکوکوس فاسیوم بودند. با روش دیسک دیفیوژن مشخص گردید ۵۶% از نمونه­ها به هر دو آنتی­بیوتیک جنتامایسین و استرپتومایسین با غلظت­های افزایش یافته مقاوم بودند. همچنین بیشترین مقاومت به تتراسایکلین مشاهده شد و ژن مقاومت در ایزوله­های ادرار بیش از بقیه نمونه­ها وجود داشت. در این مطالعه ۱۸ سویه­ به ونکومایسین نیز مقاوم بودند. نتایج PCR نشان داد حضور ژن­های aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia ، ant(4’)-Ia و aph(3’)-IIIa به ترتیب ۶۰% ، ۳۰% و ۵۰% بودند. ۹ ایزوله هر سه ژن را داشتند. همچنین ژن­های aph(2’’)-Ib ، aph(2’’)-Ic و aph(2’’)-Id شناسایی نشدند.
بحث: به دلیل وجود مقاومت دارویی در انتروکوک پیشنهاد می­ شود از روش­های مولکولی مانند PCR برای تشخیص سریع و نهایی مقاومت در کنار روش­های دیسک گزاری استفاده شود. تشخیص درست، سریع و قطعی، تنها راه جلوگیری از افزایش مقاومت به آنتی بیوتیک­ها و گسترس پدیده HLAR است.
کلمات کلیدی: انتروکوکوس فکالیس، انتروکوکس فاسیوم، مقاومت آنتی بیوتیکی، آمینوگلیکوزید، MultiplexPCR
فصل اول
کلیات
کلیات
مقدمه
انتروکوک­ها کوکسی­های گرم مثبتی هستند که اگر چه به طور معمول فلور نرمال دستگاه گوارش انسان و حیوانات محسوب می­شوند، ولی امروزه آنها به عنوان عامل مهم عفونت­های بیمارستانی مطرح هستند (۱). این باکتری­ ها به علت کسب مقاومت­های چندگانه به انواع آنتی بیوتیک­ها، به عنوان یکی از مشکلات درمانی محسوب می‌شوند. از جمله مقاومت­هایی که در انتروکوک­ها ایجاد شده است می­توان به مقاومت نسبت به دوزهای بالای آمینوگلیکوزیدها، بتالاکتام­ها و گلیگوپپتیدها اشاره کرد و از آنجائی که معمولاً ونکومایسین به عنوان آخرین راه حل درمانی برای سویه‌های مقاوم به چند دارو استفاده می­ شود (۲)، بنابراین مقاومت به ونکومایسین در بین سویه‌های انتروکوکی دارای اهمیت به سزایی است، مقاومت به آمینو گلیکوزیدها نیز به دلیل شکست درمانی در سینرژی یک داروی موثر بر دیواره باکتری (مثل پنی سیلین) و آمینو گلیکوزیدها، مشکل دیگری را در درمان آنها ایجاد کرده است (۳)، خصوصاً اینکه، این مقاومت­ها می­توانند توسط عناصر ژنتیکی مختلفی مثل ترانسپوزون­ها و پلاسمیدها بین گونه­ های انتروکوکی و حتی بین جنس­های باکتریایی منتقل شوند و در نتیجه طیف وسیعی از باکتری­ ها را درگیر کنند (۴).
حضور ژن­های مقاومت برروی کروموزم باکتریایی و یا پلاسمیدی می­توانند مقاومت به چندین آنتی­بیوتیک خانواده آمینو­گلیکوزیدی را ایجاد کند. بنابراین تعیین فراوانی ژن­های مقاومت به آمینو گلیکوزیدها می ­تواند در انتخاب یک رژیم درمانی مناسب، موثر باشد (۵).
انتروکوک­ها که سالیان متوالی، تنها به عنوان فلور غیربیماریزای دستگاه گوارش انسان و حیوانات محسوب می­شدند، در طول دو دهه گذشته، به سبب نقش موثری که در ایجاد عفونت‌های بیمارستانی داشته و استعداد ویژه­ای که در کسب مقاومت­های چندگانه نسبت به انواع آنتی بیوتیک­های مرسوم نشان داده اند، به شدت مورد توجه قرار گرفته­اند (۶, ۷).
از انواع مقاومت­هایی که نسبت به آنتی بیوتیک­های مختلف در انتروکوک­ها مشاهده می­گردد می­توان به مقاومت نسبت به دوزهای بالای آنتی بیوتیک­هایی از خانواده­های بتالاکتام­ها ( (۸)، گلیکوپپتیدها (۹) و آمینوگلیکوزیدها (۱۰) اشاره نمود.
درباره اهمیت مقاومت به دوزهای بالای آمینوگلیکوزیدها کافی است بدانیم درمان عفونت­های سیستمیک چون اندوکاردیت­ها (۱۱)، باکتریمی (۱۲)و مننژیت (۱۳) تنها در حضور رژیم­های درمانی که حاصل ترکیب آنتی­بیوتیکی با این گروه دارویی است، امکان پذیر می‌باشد. آمینو گلیکوزیدها به جهت مشاهده مقادیر روزافزون مقاومت به دوزهای بالای آنها و نقش موثری که عناصر ژنتیکی متحرک خارج کروموزمی همچون پلاسمیدها در گسترش این نوع از مقاومتها بر عهده دارند، از جایگاه ویژه­ای برخوردارند (۱۴). امروزه، دستیابی و بکارگیری بهترین، مطمئن ترین و سریعترین روش به منظور تشخیص حضور این نوع مقاومت، تعیین مقادیر MIC^[1] آنها و نیز یافتن علل انتشار و پراکندگی آنها و در آخر قضاوت پیرامون کارا بودن و یا عدم کارایی این خانواده آنتی بیوتیکی در رژیم­های دارویی، از مهمترین وظایف آزمایشگاه­های مرجع، تشخیص طبی و بیمارستان­ها می‌باشد.
بیان مسئله
انتروکوکوس شامل کوکسی گرم مثبت و کاتالاز منفی است، که تا کنون ۱۹ گونه آن شناسایی شده‌اند. اما فقط ۲ گونه از آن یعنی انتروکوکوس فکالیس وانتروکوکوس فاسیوم عامل اصلی در عفونت­های انسانی می‌باشند. این دو گونه یکی ازشایعترین عوامل عفونت­های بیمارستانی نیز محسوب می­شوند که اطلاق نام انتروکوک به دلیل توانایی حضور آنها در روده می­باشد و در ضمن این گروه یکی از مقاومترین گروه باکتری­ ها در مقابل آنتی بیوتیک­ها می­باشند (۱۵).
یکی از دلایل اصلی نقش آنها در عفونت بیمارستانی مقاومت ذاتی این باکتری به چندین آنتی بیوتیک مورد بیمارستان دیده استفاده می‌باشد و مهم‌تر اینکه شاید توانایی آنها برای دریافت مقاومت به تمام آنتی‌بیوتیک‌ها به دلیل قدرت دریافت اجزای خارجی ژنتیکی ازطریق پلاسمید است. همچنین ایجاد مقاومت می ­تواند از طریق موتاسیون صورت گیرد؛ که منجر به ایجادانتروکوک­های مقاوم به وانکومایسین می شود. کنترل این دسته بسیار مشکل شده است (۱۶, ۱۷)
روش‌های کشت به ۲۴ تا ۴۸ ساعت زمان نیاز دارد، تا باکتری رشد کرده و تعیین هویت شده و آزمایش تعیین حساسیت برای آن انجام شود(۱۸). در بعضی از موارد سرعت عمل می‌تواند جان بیمار را نجات دهد، لذا استفاده از روش مولکولی مولتی پلکس PCR جهت تشخیص باکتری‌های عامل عفونت می‌تواند مفید باشد (۱۹, ۲۰).
انتروکوک­ها^[۲]
طبقه بندی
واژه اﻧﺘﺮوﮐوک ﺗﻮﺳﻂ ﺗﯽ ﯾﺮ ﺳﯿﻠﯿﻦ ^[۳] درسال ۱۸۹۹ ﺑﺮای ﺗﻮﺻﯿﻒ ارﮔﺎﻧﯿﺴﻢ ﻫﺎی ﮐﻮﭼﮑﯽ^[۴] ﮐﻪ ﺑﻪ ﺻﻮرت ﺟﻔﺖ ﯾﺎ زﻧﺠﯿﺮه­ﻫﺎی ﮐﻮﺗﺎه در ﻣﺪﻓﻮع دﯾﺪه ﺷﺪﻧﺪ، انتخاب شد. ﻣﺸﺎﻫﺪات اوﻟﯿﻪ در ﻣﻮرد ﺧﺼﻮﺻﯿﺎت رﻧﮓ آﻣﯿﺰی ﮔﺮم، ﺷﮑﻞ، آراﯾﺶ ﺳﻠﻮﻟﯽ و ﻓﻘﺪان ﮐﺎﺗﺎﻻز، اﻧﺘﺮوﮐﻮک ﻫﺎ را ﺑﻪ ﻋﻨﻮان اﻋﻀﺎء ﺟﻨﺲ اﺳﺘﺮﭘﺘﻮﮐﻮک ﻣﻌﺮﻓﯽ ﻧﻤﻮد. ﺑﺎ ﮔﺴﺘﺮش ﺳﯿﺴﺘﻢ ﮔﺮوه ﺑﻨﺪی ﻻﻧﺴﻔﯿﻠﺪ^[۵] در ﺳﺎل ۱۹۳۳، اﻧﺘﺮوﮐﻮﮐ­­ﻬﺎ از ﻧﻈﺮ آﻧﺘﯽ ژن اﺧﺘﺼﺎﺻﯽ در ﮔﺮوه Dﻗﺮار ﮔﺮﻓﺘﻨﺪ (۲۱). ربکا لانسفیلد رده بندی جدیدی را پیشنهاد کرد. وی دریافت که اگر استرپتوکوک را در محیط کشت مایع با اسیدیته قوی ( pH=2) قرار داده و به مدت ۱۰ دقیقه در گرمای C⁰ ۱۰۰ نگه دارند ماده آنتی ژن محلولی از جنس هیدرات کربن از دیواره باکتری خارج می شود که آن را، کربوهیدرات C نامید، و بر اساس این آنتی ژن آنها را به گروه های A تا E تقسیم بندی کرد. تمام اعضای جنس انتروکوک با آنتی سرم گروه D لانسفیلد واکنش می­ دهند (۲۲, ۲۳(.
در سال ۱۹۰۶ نام انتروکوکوس فکالیس توسط اندرو و هوردر^[۶] برای ارﮔﺎﻧﯿﺴﻤﯽ ﺑﺎ ﻣﻨﺸﺄ ﻣﺪﻓﻮﻋﯽ ﮐﻪ ﺗﻮاﻧﺎﯾﯽ اﻧﻌﻘﺎد ﺷﯿﺮ، ﺗﺨﻤﯿﺮ ﻣﺎﻧﺘﯿﻮل و ﻻﮐﺘﻮز و ﻋﺪم ﺗﻮاﻧﺎیی ﺗﺨﻤﯿﺮ راﻓﯿﻨﻮز را داﺷﺖ ﺑﮑﺎر ﺑﺮده ﺷﺪ (۲۳(.
جنسون^[۷]، انتروکوکوس ﻓﺎﺳﯿﻮم را ﮐﻪ از ﻧﻈﺮ اﻟﮕﻮی ﺗﺨﻤﯿﺮی ﻣﺘﻤﺎﯾﺰ از نتروکوکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ ﺑﻮد را ﺷﺮح داد (۲۴, ۲۵(.
اﺳﺘﺮﭘﺘﻮﮐﻮﮐﻮس دوراﻧﺲ^[۸] توسط و وینگ که مشابه با استرپتوکوکوس فاسیوم با فعالیت تخمیری کمتر معرفی گردید، اما جنسن انتروکوکوس نخستین بار در سال ۱۹۸۴ توسط چلیپر و کلیفر ا از استرپتوکوکوها جدا شد. جنسن انتروکوک فقط دارای آنتی ژن گروه D است که جزء فلور نرمال دسگاه گوارش انسان می­باشد. سایر گونه­ ها که آنتی­ژن گروه D را دارند قسمتی از فلور نرمال روده را تشکیل می­ دهند و استرپتوکوک­های گروه D می­باشند (۲۶، ۲۷)
امروزه اما این جنس، گونه‌های متعددی را در خود جای می‌دهد که تعداد آنها در منابع مختلف از ۱۷ تا ۲۱ گونه متغیر بوده (۲۳, ۲۶) و در ۵ گروه قرار می‌گیرند (۲۶) . شایع‌ترین آنها دو گونه، E. faecium وE. faecalis هستند. اما گزارش‌هایی به ندرت مبنی بر مشاهده سایر گونه‌ها در عفونت‌های انسانی دیده شده است که از انواع این‌گونه‌ها می‌توان به E.durans، E. flavescens, E. munstii, E. gallinarum, E. avium, E. casseliflavus, E. raffinosus و E.hirae اشاره نمود (۲۲, ۲۶, ۲۷). حضور این‌گونه‌ها در مناطق مختلف دنیا متفاوت بوده است. به عنوان مثال در مواردی دو گونه E. gallinarum , E. casseliflavus. غالب‌ ترین انواع پس از E. faecalis وE. faecium گزارش شده است (۲۸).
خصوصیات بیولوژیک
اﻧﺘﺮوﮐﻮک­ها، ﮔﺮم ﻣﺜﺒﺖ ﺑﯽ­ﻫﻮازی اﺧﺘﯿﺎری و ﮐﺎﺗﺎﻻز ﻣﻨﻔﯽ ﻫﺴﺘﻨﺪ ﻗﺎدرﻧﺪ در ﻣﺤﯿﻂ ﺣﺎوی ۵/۶% کلرید سدیم، ۴۰ % ﺻﻔﺮا رشد می­ﮐﻨﻨﺪ. آﻧﻬﺎ معمولاً در pH محدوده ( ۶ الی ۹) و در دمای C⁰ ۴۵-۱۰رشد می‌کنند. انتروکوک­ها در C⁰ ۶۰، ۳۰ دقیقه زنده می­مانند. اما رشد بهینه آنها در C⁰ ۳۷مشاهده می‌گردد. این باکتری‌ها همچنین توانایی رشد در NaCI 6.5%, pH=9.6 و نمک­های صفراوی را داشته و اغلب آنها قادر به هیدرولیز پیروات می‌باشند (۲۹, ۳۰). اعضای این گروه به راحتی قادر به رشد بر روی محیط (Blood Agar) BA بوده و غالباً قادر به لیز گبلول­های قرمز نمی­باشند (همولیز γ) اما انواع آلفا (α) و بتا (β) نیز در میان آنها مشاهده می‌گردد (۳۱). به طوری که نوع β در میان ۱۰ گونه از انواع انتروکوک­ها دیده می‌شود. این باکتری‌ها قادرند به راحتی شرایط سخت محیطی را تحمل کنند (۳۲). لذا هر جایی در طبیعت، از جمله خاک، غذا، آب، حیوانات، پرندگان و حشرات قابل جداسازی هستند (۳۳).
انتروکوک­ها، کموارگانوتروف^[۹] با متابولیسم جور تخمیر بوده و دامنه وسیعی از کربوهیدرات‌ها را تخمیر می‌کنند که محصول عمده این فرایند اسیدلاکتیک است و هیچ گازی تولید نمی‌گردد.
این باکتری­ ها فاقد آنزیم­ های سیتوکروم هستند، اما گاهی اوقات تولید کاتالاز کاذب می­ کنند . تقریباً ﻫﻤﻪ سویه‌ها ﻫﻤﻮﻓﺮﻣﺎﻧﺘﺎﺗﯿﻮ^[۱۰] ﺑﻮده و از ﺗﺨﻤﯿﺮ ﮔﻠﻮکز، اسیدلاکتیک ﺗﻮﻟﯿﺪ می‌کنند. آﻧﺘﯽ ژن ،D ﯾﮏ ﮔﻠﯿﺴﺮول ﺗﯿﮑﻮﺋﯿﮏ اﺳﯿﺪ ﻣﺮﺗﺒﻂ ﺑا دیواره سلولی اﺳﺖ ﮐﻪدرهمه سویه­ها وجود دارد. درﺻﺪ ﮔﻮاﻧﯿﻦ + ﺳیتوزﯾﻦ آﻧﻬﺎ ۳۷-۴۵ درصد می‌باشد (۳۴).
تقسیم‌بندی ﻣﻮﻟﮑﻮﻟﯽ
بر اساس توالی ۱۶SrRNA گونه­ های انتروکوک در چندین گروه قرار گرفته اند(۳۵)
ﮔﺮوه اﻧﺘﺮوکوکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ^[۱۱]: ﺷﺎﻣﻞ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ، ﻫﻤﻮﭘﺮاﮐﺴﯿﺪاز و ﻣﻮراوﻧﺴﯿﺲ.
ﮔﺮوه اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﺎﺳﯿﻮم^[۱۲]: ﺷﺎﻣﻞ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﺎﺳﯿﻮم، دوراﻧﺲ، ﻫﯿﺮه، ﻣﻮﻧﺪﺗﯽ، ﭘﻮرﮐﯿﻨﺰ و وﯾﻠﻮروم.
ﮔﺮوه اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس آوﯾﻮم^[۱۳]: ﺷﺎﻣﻞ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس آوﯾﻮم، ﭘﺴﻮدواوﯾﻮم، ﻣﺎﻟﻮدوراﺗﻮس وراﻓﯿﻨﻮزوس .
ﮔﺮوه اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﮐﺎﺳﻠﯽ ﻓﻼووس^[۱۴]: ﺷﺎﻣﻞ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﮐﺎﺳﻠﯽ ﻓﻼووس، ﮔﺎﻟﯿﻨﺎروم، ﻓﻼووﻧﺲ
ﮔﺮوه اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﺳﮑﻮروم^[۱۵]: ﺷﺎﻣﻞ اﻧﺘﺮوکوکوس ﺳﮑﻮروم و ﮐﻠﻮﻣﺒﺎ.
ﮔﺮوه اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس دﯾﺴﭙﺎر^[۱۶]: ﺷﺎﻣﻞ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس دﯾﺴﭙﺎر و اﺳﯿﻨﯽ.
ﮔﺮوه ﺳﺎﮐﺎروﻟﯿﺘﯿﮑﻮس^[۱۷]: ﺷﺎﻣﻞ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوسﺳﺎﮐﺎروﻟﯿﺘﯿﮑﻮس، ﺳﻮﻟﻔﻮروس
ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ انتروکوکوس فکالیس
ﮔﻮﻧﻪ­ﻫﺎی اﻧﺘﺮوﮐﻮک را ﺑﺮ اﺳﺎس ﺗﻮاﻧﺎﯾﯽ ﺗﺸﮑﯿﻞ اﺳﯿﺪ در ﻣﺤﯿﻂ ﺣﺎوی ﻣﺎﻧﯿﺘﻮل و ﺳﻮرﺑﻮز ﺑﺮاث و ﻫﯿﺪروﻟﯿﺰآرژﯾﻨﯿﻦ ﺑﻪ ﭘﻨﺞ ﮔﺮوه تقسیم‌بندی کرده‌اند (۳۵).
ﮔﺮوه اول ﺗﻮاﻧﺎﯾﯽ ﺗﺸﮑﯿﻞ اﺳﯿﺪ در ﻣﺤﯿﻂ ﻣﺎﻧﯿﺘﻮل ﺑﺮاث و ﻫﯿﺪروﻟﯿﺰ آرژﯾﻨﯿﻦ را داﺷﺘﻪ اﻣﺎ ﺳﻮرﺑﻮز ﻣﻨﻔﯽ می‌باشند. انتروکوکوس فکالیس در این دسته قرار می‌گیرد. این‌گونه ﻣﺴﺌﻮل ۹۰-۸۵ % عفونت‌های اﻧﺘﺮوﮐوﮐﯽ اﻧﺴﺎن اﺳﺖ. ﻋﻼوه ﺑﺮ روده اﻧﺴﺎن، در دﺳﺘﮕﺎه ﮔﻮارش ﻣﺮغ، ﮔﻮﺳﺎﻟﻪ، ﺧﻮک، اﺳﺐ، ﮔﻮﺳﻔﻨﺪ و ﺑﺰ ﻧﯿﺰ ﯾﺎﻓﺖ می‌شود. وﺟﻪ ﺗﻤﺎﯾﺰ آن از دﯾﮕﺮ اﻋﻀﺎ ﮔﺮوه ۲، ﻣﻨﻔﯽ ﺑﻮدن ﺗﺴﺖ آراﺑﯿﻨﻮز اﺳﺖ. ﺗﻌﺪادی از وارﯾﺎﻧﺖ­ﻫﺎی آن ﻗﺎدر ﺑﻪ ﺗﺤﻤﻞ ﺗﻠﻮرﯾﺖ و اﺳﺘﻔﺎده از ﭘﯿﺮووات می‌باشند.