ابتدا به مدت سه دقیقه با نیمی از محلول A ژل را بر روی shaker شستشو می دهیم. بعد از مدت مورد نظر محلول را خالی کرده وبا بقیه محلول A به مدت سه دقیقه شستشو را ادامه می دهیم. سپس محلول را خالی می کنیم.
محلول B را به طور کامل به ظرف رنگ آمیزی منتقل کرده و به مدت ۱۵ دقیقه بر روی Shaker رنگ آمیزی می کنیم. پس از مدت مورد نظر محلول را خالی کرده و ژل را در آب مقطر شستشو می دهیم.
حالا محلول C را اضافه می کنیم و ظرف را آن قدر روی Shaker قرار می دهیم تا باند های DNA ظاهر شود. پس از رنگ آمیزی محلول را خالی کرده و رنگ آمیزی نیترات نقره را با اضافه کردن آب مقطر متوقف می کنیم.
۳-۴-۵-۴-۳ بررسی ژل های پلی آکریل آمید (Homozygosity Mapping)
مارکرهای STR دارای الگوی توارث مندلی می باشند و می توان بدین منظور الگوی توارث ۲ آلل یک جایگاه ژنی را از پدر و مادر به فرزندان ردیابی کرد.
در روش Homozygosity Mapping به دلیل این که در مورد بیماری های مغلوب کاربرد دارند، در صورتی که ژن موجود در جایگاه ژنی مورد بررسی عامل بیماری باشند، به دلیل به ارث بردن آلل مشترک از جد مشترک، فرد بیمار برای آن آلل مورد نظر باید هموزیگوت باشد. بنابراین در بررسی به وسیله مارکرها فقط یک باند قابل رویت است.

برای پی بردن به وجود جهش در لوکوس های مورد نظر، در ابتدا ۳ مارکر که دارای هتروزیگوسیتی بالایی در جمعیت ایران بود و نسبت به مارکرهای دیگر نزدیک ترین فاصله را به ژن موردنظر داشتند، انتخاب شدند و برای هر خانواده پدر، مادر، فرزندان بیمار و یک فرزند سالم مورد بررسی آنالیز پیوستگی قرار گرفتند. در صورتی که این مارکرها در خانواده موردنظر informative نبودند و یا جواب آن ها مثبت بود،پیوسته به ژن مورد نظر بودند یعنی افراد بیمار در روی ژل پلی آکریل آمید فقط یک باند داشتند و افراد سالم یک و یا دو باند داشتند، برای پیدا کردن جهش به روش مستقیم تعیین توالی آماده می شدند
۳-۴-۶ پیدا کردن جهش به روش مستقیم تعیین توالی
به کمک روش آنالیز پیوستگی فقط می توان به طور غیر مستقیم به وجود جهش در ژن موردنظر پی برد. برای تایید وجود جهش و تعیین نوع و جایگاه جهش، از روش مستقیم تعیین توالی^[۶۳] استفاده کردیم.
Sequencing به دو روش انجام می شود:
روش آنزیمی که به روش Gilbert معروف است.
روش شیمیایی که به روش Sanger معروف است. امروزه تعیین توالی به روش سنگر، بیشترین کاربرد را در تجزیه و تحلیل توالی DNA دارد.
اصول کلی هر دو روش تعیین توالی، قطعه قطعه کردن رشته DNA به چهار سری از قطعات نشاندار می باشد. واکنش تولید کننده هر کدام از این سری ها دارای ویژگی بازی بوده و بنابراین طول قطعات DNA حاصل بستگی به موقعیت های باز مورد نظر در داخل توالی DNA دارد.
تعیین توالی به روش سنگر، از آنالوگ های شیمیایی نوکلئوتیدها برای مهار آنزیم DNA پلیمراز به هنگام ساخت رشته مکمل رشته الگو که باید توالی آن تعیین شود، بهره می برد. برای انجام توالی یابی، ساخت DNA با یک الیگونوکلئوتید کوتاه (پرایمر) آغاز شده و DNA پلیمراز در طول توالی رشته الگو پیش رفته و طول پرایمر را گسترش و نوکلئوتیدهای دارای نشان رادیواکتیو یا نوکلئوتیدهای حامل برچسب فلورسانت را در داخل توالی نوساخته جای می دهد[۸۶]. با اضافه کردن یکی از آنالوگ های مهاری همراه با هر چهار نوکلئوتید طبیعی به هر یک از چهار واکنش تعیین توالی، می توان اطلاعاتی درباره توالی نوکلئوتیدی به دست آورد، زیرا وقتی DNA پلیمراز این آنالوگ را جای دهد، گسترش درصدی از مولکول های DNA متوقف خواهد شد. مقادیر نسبی نوکلئوتیدهای طبیعی و آنالوگ آن ها به یکدیگر طوری تنظیم شده که رشته هایی با طول‌های مختلف ساخته شود. وقتی این نمونه بعداً توسط الکتروفورز در ژل تجزیه و تحلیل شد تعدادی نوار با طول های منطبق بر محل هر یک از واحدهای نوکلئوتیدی مشاهده می شود. این کار در هر دو جهت انجام می شود و سپس نتایج حاصله توسط نرم افزارهای مربوطه مورد آنالیز قرار می گیرد.
در این جا برای نمونه چگونگی تعیین توالی ژن GJB4 شرح داده می شود:
ابتدا توالی مرجع ژن GJB4 را از وب سایت بیوانفورماتیکی UCSC Genome یافتیم [۸۲].
دو جفت پرایمر به کمک وب سایت UCSC (exon primer) و Primer3 طوری طراحی شد که کل قاب خواندنی این ژن که دارای ۲ اگزون می باشد را در برگیرد. این پرایمرها طوری طراحی شدند که تمام نواحی اتصال اینترون و اگزون را هم در برگیرند[۸۸,۸۹].
چون پرایمرها با هدف انجام تعیین توالی طراحی شدند، طوری انتخاب شده بود که حدود ۳۰-۲۰ نوکلئوتید داخل اینترون باشند چون نتایج حاصل از تعیین توالی در ۳۰-۲۰ نوکلئوتید اول قابل خواندن نیست.
درواکنش PCR پرایمرها به دو طرف توالی هدف اتصال می یابند و امکان شروع فعالیت پلیمرازی آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می آورند. بنابراین اولین خصوصیت پرایمر، توالی صحیح آن جهت جفت شدن با محل مورد نظر DNA برای تکثیر است. برای طراحی پرایمرها باید به موارد زیر توجه کرد:
طول پرایمر بین ۱۷ تا۳۰ باز باشد.
پرایمرها توزیع یکنواختی از توالی های غنی از A/T و G/C داشته باشند.
انتهای ´۳ آغازگرهای به کاررفته در یک واکنش نباید با یکدیگر مکمل باشند. در غیر این صورت تشکیل دایمرهای الیگونوکلئوتید می دهند که باعث کاهش عملکرد واکنش می گردد.
پرایمرها دارای توالی تکراری در طول ژنوم نباشند که موجب تکثیر نابجای قطعه ی دیگری به جای قطعه مورد نظر شود.
سپسDNA یکی از افراد مبتلا خانواده هایی که طبق نتایج حاصله از آنالیز پیوستگی به ژن GJB4 پیوستگی داشتند انتخاب شدند و با هر ۲ جفت پرایمر تکثیر شدند.
تکثیر قطعات مورد نظر طی واکنش PCR انجام می شود. سپس برای اطمینان از تکثیر DNA و مناسب بودن کیفیت محصولات PCR جهت تعیین توالی، محصولات PCR را بسته به طول قطعه، بر روی ژل آکریل آمید ۸ درصد و یا آگارز ۲% run می کنیم.
۳-۴-۶-۱ الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز
الکتروفورز روی ژل آگارز روشی استاندارد جهت جدا سازی، تشخیص و تخلیص قطعات DNA است. همان طور که درجدول زیر نشان داده شده است، درصد ژل آگارز به طول قطعات DNA بستگی دارد.
۳-۴-۶-۱-۱ مواد لازم جهت انجام الکتروفورزDNA برروی ژل آگارز
بافر TAE
این بافر معمولاً با غلظت ۵۰ برابر (x50) تهیه و در دمای اتاق نگهداری می شود. هنگام کار باید رقیق گردد TAE lX)).
Tirs-base gr 242
اسیداستیک گلاسیال .ml 1/57
M5/0 EDTA (8 pH) ml100
آب مقطر با حجم ml1000
بافر بارگذاری^[۶۴] سایبرگرین
رنگ های SYBER در DMSO ذخیره و نگهداری می شوند. این بافر با غلظت ۱۰X تهیه و در فریزر نگهداری می شود و با رقت ۱:۱۰۰۰ مورد استفاده قرار می گیرد. بهتر است که با رقت متوسط ۱:۱۰۰ در فریزر نگهداری شود.
جدول ۳-۱۴ مواد سازنده بافر بارگذاری