۲- مواد پپتیدی هضم شده حیوانی ۵Gms/lit
۳- محتویات بافتی ۵Gms/lit
۴- دکستروز ۴۰Gms/lit
۵- آگار ۱۵Gms/lit
طرز تهیه محیط سابرودکستروز آگار با توجه به توصیه کارخانه سازنده به این ترتیب می‌باشد که ۶۵ گرم از پودر محیط را با ۱۰۰۰ میلی لیتر از آب مقطر مخلوط کرده و در تماس مستقیم با حرارت قرار داده می‌شود و بعد از اینکه شفافیت مطلوب خود را دریافت نمود در داخل اتوکلاو به درجه حرارت ۱۲۱ درجه سانتی گراد و با فشار ۱۵ پوند به مدت ۱۵ دقیقه قرار داده می‌شود و همان طوری که توصیه شده است برای اینکه پودر در محیط در حین نگهداری کیفیت خود را از دست ندهد بایستی در یک مکان خشک و خنک به دور از نور نگهداری شود.

۳-۳-۱- محیط کشت سابرودکستروز آگار
بسته به حجم نمونه‌ای که از ملتحمه گاو ها اخذ گردیده است و با توجه به توصیه کارخانه سازنده ، محیط کشت آزمایشگاهی به روش زیر تهیه گردید.
ابتدا پودر به میزان لازم توسط ترازوی دیجیتالی اندازه گیری شده و با آب مقطر داخل یک بالن ریخته می‌شود . بعد از اینکه محلول حاوی محیط ، شفافیت خود را به دست آورد در داخل اتوکلاو گذاشته می‌شود (۱۲۱ درجه– ۱۵ پوند– ۱۵ دقیقه). در نهایت در درون پلیت ها ریخته شد. بعد از انعقاد محلول در داخل پلیتها محیط کشت سابرودکستروز آگار آماده گردید. لازم به ذکر است تمام مراحل فوق در کنار شعله صورت گرفت.
۳-۳-۲- کشت در محیط سابرودکستروز آگار
برای هر نمونه تهیه شده از هر چشم یک پلیت در نظر گرفته شد. این کار باید در کنار شعله و با بهره گرفتن از دستکش های استریل صورت گیرد. زیرا امکان پخش آلودگی از محیط انتقالی به اطراف وجود دارد. لذا این مرحله با احتیاط مضاعف و در کنار شعله صورت گرفت. برای کشت ، سواپ با ملایمت روی سطح محیط کشت به صورت یکنواخت کشیده شد و این در حالی است که نباید هیچ گونه فشار دست بر روی محیط وارد شود (محیط خراش بر ندارد).
بعد از کشت درب تمام پلیت ها توسط چسپ پارافیلم به شکل کاملاً محکم بسته شد و به مدت دو هفته در داخل انکوباتور در دمای ۲۸ درجه سانتی گراد به طور وارونه قرار داده شد تا قارچ ها به صورت کامل رشد کنند.
۳-۴- نمونه برداری حیوانات
برای انجام تحقیق حاضر در تاریخ ۱۵/۵/۱۳۹۲ به کشتارگاه واقع در شهرستان ارومیه جهت نمونه برداری مراجعه شد. از تعداد ۸۲ مورد کیسه ملتحمه چشم ۴۱ گاو هلشتاین نمونه گیری به عمل آمد. برای انجام این کار ، با بهره گرفتن از دماغ گیر گاو مقید می‌شد و پس از آرام شدن ، چشم حیوان از لحاظ وجود ضایعاتی همچون سرخی ملتحمه ، ریزش اشک ، عروقی شدن و کدورت قرنیه مورد مشاهده قرار می‌گرفت و در صورت عدم وجود مشکل ، نمونه گیری به عمل می‌آمد. بدین منظور سواپ‌های استریل که روز قبل در آزمایشگاه میکروبیولوژی تهیه شده بودند به درون کیسه ملتحمه چشم پایین کشیده می‌شدند و بلافاصله درون لوله های آزمایش حاوی محیط انتقالی آب پپتونه قرار می‌گرفتند. همزمان در یک برگه مشخصات دام شامل سن ، جنس و چپ و راست بودن چشم حیوان یادداشت می‌شد. پس از اتمام نمونه گیری ، نمونه ها در کنار یخ به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد ارومیه منتقل شده و ۴۸ ساعت در گرم خانه ۳۷ درجه سانتی گراد نگهداری می‌شدند.
۳-۵- بررسی نتایج کشت
بعد از رشد کامل ، پرگنه های قارچی مورد بررسی قرار گرفت. قطعه‌ای از پرگنه در کنار شعله توسط آنس برداشته شده و روی لام قرار داده می‌شد (جهت تهیه لام وتمانت) و توسط لاکتو فنول کاتن بلو رنگ آمیزی می‌گردید. این در حالی است که قطعه برداشته شده توسط آنس کاملاً باز می‌گردید تا اجزای ساختمانی آن در زیر میکروسکوپ قابل رویت گردد. این کار با احتیاط کامل صورت می‌گرفت زیرا امکان دارد در حین خرد کردن به ساختمان قارچ آسیب وارد شود. بعد از آماده سازی گسترش ، توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ۱۰X و ۴۰X مورد بررسی قرار گرفت.
۳-۶- آنالیز آماری
تجزیه‌و‌تحلیل آماری داده‌ها با بهره گرفتن از نرم‌افزار SAS ویرایش ۲/۹ انجام پذیرفت تمامی داده‌ها بر اساس سطح احتمال پنج درصد (۰۵/۰>P) مورد بررسی قرار گرفتند.
برای تعیین تفاوت فراوانی جدایه ها در گروه سنی مختلف و جنس ها از آزمون من ویتنی و در مواردی که تعداد جدایه ها کم بود از آزمون دقیق فیشر استفاده گردید .برای تعیین همبستگی بین میزان جداسازی قارچ ها و سن گاوها از آزمون همبستگی کندال تاو استفاده شد.
فصل چهارم
نتایج
۴-۱- نتایج
تحقیق حاضر بر روی ۴۱ گاو سالم انجام گرفت. در کل از ۲۷ چشم (۹۳/۳۲% درصد ) ، تعداد ۳۴ جدایه (۶گونه ) شناسایی گردید.فراوانی قارچ های رشته ای به ترتیب زیر می باشد
آسپرژیلوس (۷۵/۴۳%)، کورولاریا(۷۵/۱۸%)، پنی سیلیوم (۶۲/۱۵%)، پزودوآلشریا (۶۲/۱۵%)، فوزاریوم (۱۲/۳%) و اسکوپولاریوپسیس (۱۲/۳%).
از ۲۴ راس گاو مثبت برای کشت قارچی ، تعداد ۳ راس (۳۲/۷ درصد) برای هر دو چشم مثبت بودند و تعداد ۱۶ راس (۳۹ درصد) فقط برای چشم راست مثبت بودند و تعداد ۱۱ راس (۸/۲۶درصد) فقط برای چشم چپ مثبت بودند و تعداد ۱۷ راس (۵/۴۱ درصد) برای هر دو چشم منفی بودند.
نتایج کشت از ۴۱ راس گاو و ۸۲ چشم ، تعداد ۲۴ چشم (۳/۲۹ درصد) واجد یک گونه قارچی بودند و تعداد ۳ چشم (۷/۳ درصد) واجد دو گونه قارچی و تعداد ۵۵ چشم (۱/۶۷ درصد) برای کشت قارچی استریل بودند.
۴-۲-جنس
در تحقیق حاضر ۲۵ راس (۶۱ درصد ) از گاو ها مربوط به جنس نر بودند و ۱۶ راس (۳۹ درصد ) مربوط به جنس ماده بودند از کل جدایه های حاصل از چشم گاو ها ،۱۹ جدایه (۹/۵۵ درصد ) مربوط به جنس نر و ۱۵ جدایه (۱/۴۴ درصد ) مربوط به جنس ماده بودند. ۱۰ راس از گاوهای نر (۴/۲۴ درصد ) و۷ راس از گاو های ماده (۱/۱۷ درصد ) فاقد جدایه های قارچی بودند.
۴-۳-چشم
تعداد ۲۰ جدایه (۸/۵۸درصد ) مربوط به چشم راست بودند و تعداد ۱۴ جدایه (۲/۴۱ درصد ) مربوط به چشم چپ بودند. ۲۵ چشم راست (۵/۳۰ درصد ) و ۳۰ چشم چپ (۶/۳۶ درصد ) از نظر حضور قارچ استریل بودند.
۴-۴-نتایج آماری
براساس آزمون مربع کای و در مواردی آزمون دقیق فیشر فراوانی جداسازی اسپرژیلوس فومیگاتوس در گاو های گروه سنی بالای یکسال از فراوانی معنی داری برخوردار بود (۰۲۲/۰P=)
براساس همین آزمون ها فراوانی پنیسلیوم نیز در همین گروه سنی از فراوانی معنی داری برخوردار بود (۰۲۴/۰P=)
تنها قارچی که در گروه های جنسی تفاوت آماری معنی داری نشان داد قارچ پزودوآلشریا با فراوانی معنی دار در گاو های نر بود (۰۴۹/۰P=).
جدول ۴-۱ : جدایه های قارچی کیسه ملتحمه چشم گاو هلشتاین سالم به تفکیک گروه سن