۲-۴ اسکلت پایه فلاونوئید ۲۹

۲-۵ مسیر بیوسنتز آرتمیزنین ۳۲

۲-۶ شکل شماتیک از فعال شدن سیستم دفاعی گیاه در اثر تیمار با محرک ۵۵

۵-۱ اثر هورمون ۲,۴-D بر وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه برگی ۸۳

۵-۲ اثر هورمون BAP بر وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه برگی ۸۳

۵-۳ اثر متقابل هورمون ۲,۴-D و BAP بر وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه برگی ۸۳

۵-۴ کالوس حاصل از ریزنمونه برگ ۸۳

۵-۵ کالوس حاصل از ریزنمونه ساقه ۸۳

۵-۶ اثر هورمون BAP بر باززایی غیرمستقیم ریزنمونه برگی ۸۷

۵-۷ اثر هورمون Kin بر باززایی غیرمستقیم ریزنمونه برگی ۸۷

۵-۸ اثر هورمون BAP بر باززایی غیرمستقیم ریزنمونه ساقه ۸۷

۵-۹ گیاهچه حاصل از باززایی غیرمستقیم برگ ۸۸

۵-۱۰ گیاهچه حاصل از باززایی غیرمستقیم ساقه ۸۸

۵-۱۱ اثر متیل جاسمونات بر میزان آرتمیزنین در کالوس ۸۹

۵-۱۲ میزان پروتئین در نمونه های شاهد و تیمار شده باMJA (µM50 و ۱۵۰ ) و SA (mg/50 ml culture 2و۴) در زمان های مختلف (۱۲۰ و ۴۸ ساعت) ۹۱

۵-۱۳ فعالیت آنزیمASC در نمونه های شاهد و تیمار شده باMJA (µM50 و ۱۵۰ ) و SA (mg/50 ml culture 2و۴) در زمان های مختلف (۱۲۰ و ۴۸ ساعت) ۹۲

فهرست جدول ها صفحه

۲-۱ گروه های اصلی ترکیبات مهم تجاری حاصل از گیاهان ۵۱

۳-۱ مطالعات کشت بافت A.annua 61

۳-۲ مواد تشکیل دهنده محیط پایه Ms 71

۵-۱ اثر تیمارهای هورمونی بر درصد کالوس دهی ۸۲

۵-۲ نتایج بدست آمده از محیط های مختلف در القای کالوس ۸۲

۵-۳ اثر تیمارهای هورمونی بر درصد باززایی ۸۵

۵-۴ نتایج بدست آمده از محیط های مختلف در باززایی غیرمستقیم ۸۷

۵-۵ میزان آرتمیزنین در کالوس تیمار شده با µM 50 متیل جاسمونات و شاهد پس از ۱۲۰ ساعت ۸۹

۵-۶ اندازه گیری پروتئین بدست آمده از کالوس ۹۰

۵-۷ فعالیت آنزیم ASC پس از اعمال تیمار ۹۲

مقدمه

۱-۱- مقدمه

امروزه متابولیت های ثانویه^[۱] به عنوان منبعی برای تولید دارو، افزودنی های غذایی، طعم دهنده ها و درمان بیماری ها به کار می روند (Sairam, R. et al. 2002). قدیمی ترین اطلاعات استفاده از گیاهان به عنوان دارو از سومریان و مصریان مربوط به حدود ۱۵۵۰ سال تا ۳ هزار سال پیش از میلاد مسیح می باشد (اصغری، غ ر. ۱۳۸۵). ترکیبات طبیعی را می توان به عنوان ترکیبات راهنما برای طراحی منطقی داروهای جدید، توسعه الگو برداری از سنتز آنها و کشف اثرات درمانی جدید مورد استفاده قرار داد (اصغری، غ ر. ۱۳۸۵). گیاه A.annua منبع یک داروی مهم گیاهی سنتی در چین به نام Qing Hao است که در حدود بیش از ۲۰۰۰ سال به عنوان داروی کاهنده تب استعمال می شده است. ترپنوئیدها و فلاونوئیدهای متعدد استخراج شده از A.annua فعالیت ضد سلولی^[۲] مهمی را در هنگام آزمایش روی تومور در انسان نشان داده است. در بین این مواد، آرتمیزین و کورستاژتین^[۳] به عنوان ماده موثر در این فعالیت ضدسلولی مهم اثبات شده اند. همچنین عصاره های استخراج شده از قسمت های هوایی گیاه A.annua که در مجاورت هوا خشک شده اند، دارای فعالیت تعدیل مصونیت از طریق تکثیر لنفوسیت نوع T بوده اند. بر اساس مطالعات انجام شده ۲۴ ترکیب در اسانس گونه A.annua مشاهده شده است. ترکیبات اصلی این اسانس، آرتمیزیا کتون، ۱و۸- سینئول، پینوکاروون، بتا–سلینن، کامفور و گاما- مورولن می باشند) مینا ربیعی، ۱۳۸۲). یکی از مهمترین ترکیبات دارویی این گیاه، آرتمیزینین^[۴] از گروه متابولیت های ثانویه موسوم به لاکتون سزکویی ترپن اندوپراکسیدها می باشد که فعالیت مؤثری را برعلیه نژادهای انگل پلاسمودیوم^[۵] عامل بیماری مالاریا از خود نشان می دهند. از آنجا که در گزارشات سازمان بهداشت جهانی موارد مقاوم این انگل به داروهای فعلی نظیر کلروکوئین، سولفادوکسین و پرپمتامین یافت شده، به همین دلیل تولید تجاری و انبوه آن مورد توجه خاصی قرار گرفته استKalyman , D. L. 1985)). عملکرد نسبتاٌ کم [۰۸/۱ – ۰۱/۰ درصد] این ماده در گیاه محدودیت عمده ای در تولید تجاری آن است. تغییرات در شرایط کشت و محیط رشد در کشت های سلولی و تغییر سطوح هورمون های رشد در کشت بافت به منظور بالا بردن مقدار آرتمیزنین چندان موفق نبوده است و از طرف دیگر به دلیل منابع محدود و مشکلات ساخت مصنوعی – شیمیایی این ماده مورد توجه قرار نگرفته است. به همین دلیل در سالهای اخیر تلاش های زیادی برای افزایش آرتمیزنین از گیاه فوق به کمک الیسیتورها صورت گرفته است(Archana, G. et al. 2002). کاربرد محرک های زنده^[۶] (مانند: متیل جاسمونات^[۷] و عصاره مخمر^[۸]) یک استراتژی مهم در تغییر میزان فعالیت آنزیم های دخیل در مسیر بیوسنتز متابولیت های ثانویه و در نتیجه افزایش تولید آنها می باشد (Zaho, J. et al. 2001).

بنابر این در این تحقیق اثرات محرک های^[۹] مختلف (متیل جاسمونات و سالسیلیک اسید^[۱۰]) بر تولید آرتمیزنین، تجمع پروتئین و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز^[۱۱] مورد بررسی قرار گرفته است.

۱-۲-اهداف پژوهش:

• معرفی بهترین هورمون جهت کالوس زایی در گیاه درمنه خزری.
• معرفی بهترین غلظت هورمون جهت کالوس زایی.
• معرفی بهترین هورمون جهت باززایی.
• معرفی بهترین غلظت هورمون جهت کالوس زایی.
• معرفی بهترین محرک به منظور حداکثر تولید آرتمیزنین.
• معرفی بهترین غلظت محرک به منظور حداکثر تولید آرتمیزنین.
• بررسی تغییرات میزان پروتئین و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در برابر محرک.

۱-۲-ویژگی های گیاه شناسیArtemisia annua

درمنه (A.annua)از دولپه ای ها، راسته Asterales، خانواده Asteraceae و قبیله Anthemedeae است. گیاهی است یکساله، راست (برافراشته)، بدون کرک یا دارای کرک های پراکنده، ساقه منفرد به ارتفاع ۱۰۰-۳۰ سانتی متر، برگها ۵-۳ ×۴-۲ سانتی متر، دارای دمبرگی بلند، دو بار شانه ای منقسم، پانیکول بسیار بزرگ با شاخه های به طور تقریبی ۲۵ سانتی متر، کلاپرکها متعدد، دمگل دار، واژگون، کروی، نهنج بدون کرک، جام گل لوله ای باز، پنج دندانه ای، زردرنگ می باشد که در گرگان، مازندران و گیلان از پراکنش نسبتا وسیعی برخوردار است.)مظفریان، ولی ا…، ۶۸-۱۳۶۷(

گیاهشناسی تیره آستراسه (کاسنی)^[۱۲]

نام لاتین کاسنی از Aster، که یک واژه یونانی به معنای ستاره می باشد مشتق شده است و کمپوزیته، یک نام قدیمی اما هنوز معتبر برای این تیره است که اشاره به نوعی گل آذین مشخص دارد که از ویژگی های تیره آستراسه به حساب می آید (Cronquist 2001).

بزرگترین جنس های این تیره Senecio (1000 گونه)، Vernonia (1000گونه)، Centaurea (700 گونه)، Cousinia (600 گونه)، Helichrysum (550 گونه) و Artemesia (550 گونه) هستند (Wagenitz 1976).

اکثر اعضای تیره کاسنی ساختار علفی دارند، اما تعداد قابل توجهی نیز به شکل درختچه، تاک و درخت دیده می شوند (Judd, Campbell et al. 1999).

فرم رویشی گیاهان این تیره به صورت علفی یا خشبی، یکساله تا چند ساله است.

سیستم ریشه ای آنها راست ریشه^[۱۳] با ساقه مستقیم و دارای برگ های متناوب، غالباٌ با بریدگی های گوناگون است. گل ها به صورت گلهای کناری در کپه های ناجور جنس ماده یا ماده عقیم، گلهای طبقی (لوله ای) نر ماده یا به ندرت ماده یا نر عقیم، عموماٌ ماده یا به تخمدان تقلیل یافته و از نظر عمل نر با لوله ای یا به ندرت لوله ای – نخی شکل، غالباٌ زرد یا به ندرت سبز مایل به قرمز (مظفریان ۱۳۸۷).

جام گل در این تیره سفید، قرمز یا زرد، زبانه ای یا پهن شده نامنظم و ۲ تا ۳ لوبه یا لوله ای باریک و با شکافهای نامنظم و دندانه دار یا به ندرت کاملاٌ لوله ای است.

میوه ها به صورت فندقه هم شکل یا به ندرت ناجور شکل، ۲ تا ۱۰ رگه ای یا ۱ تا ۳ باله، استوانه ای یا با سطح پشتی- شکمی فشرده هستند. کلاله در گل های این تیره وجود ندارد یا وجود دارد، کاهکی، تاج مانند یا گوشک دار مورب، به ندرت متشکل از فلس های بسیار باریک متعدد است. کیسه های بساک با قاعده دم دار یا به ندرت بدون دم، با رأس زایده دار است. خامه گل سربریده، با رأس قلم موئی، با کلاله خطی کناری است.

شکل ۲-۱: ساختار گل در تیره کاسنی

(Australian National Botanic Gardens 2011)

۲-۱-۲-پراکنش جغرافیایی تیره آستراسه (کاسنی)

این تیره در سراسر جهان به استثنای قطب جنوب و قطب شمال توزیع شده، ودر مناطق خشک ^[۱۴] و نیمه خشک ^[۱۵] ، عرض های جغرافیایی معتدل ، نیمه گرمسیری و پایین شایعترین پوشش گیاهی است (Valles and McArthur 2000).

۲-۱-۳-گیاهشناسی جنس آرتمیزیا (درمنه)

تا کنون بیش از ۵۰۰ گونه برای این سرده شناسایی شده است (LI,Jiang et al.2012). فرم رویشی درمنه، علفی یا خشبی و بوته مانند ،یکساله دوساله تا چند ساله هستند. دارای سیستم ریشه ای، راست ریشه با ساقه برافراشته یا ایستاده، گاهی افتان و گسترده روی زمین، ساقه ها متعدد، در برخی گونه ها بدون انشعاب است. برگ هامتناوب، بدون کرک یا به اشکال گوناگون کرک دار، کرک ها ۲ شاخه، به ندرت ستاره ای یا ساده، در بالا اغلب حاوی کرک های غده ای منقوط بدون پایک، پهنک شانه ای بخش یا شانه ای بریده یا ۲ تا ۴ بار شانه ای بخش، به ندرت ساده، دندانه دار، قاعده ای ها دمبرگ دار، برگ های ساقه ای اغلب بدون دمبرگ یا دمبرگ کوتاه دارند. گل آذین در گل های جنس آرتمیزیا با شمای عمومی گل آذین پانیکول یا سنبله ای- خوشه ای است.

گل های جنس آرتمیزیا همگی لوله ای، در کپه های جور جنس نر ماده، ۵ دندانه ای، تعدادی از گلها عملاٌ عقیم یا در کپه های ناجور جنس کپه ها با گلهای کناری ماده لوله ای نخی شکل، در بالا ۲ دندانه ای و گل های مرکزی نر ماده و بارور با رأس ۵ دندانه ای یا در کپه های با گل های کناری ماده و گلهای مرکزی عملاٌ نر در بالا ۵ دندانه ای. میوه به شکل فندقه، بدون کرک، بدون کاکل، مستعطیلی باریک، کوچک، با جای زخم ناشی از اتصال لوله گل جانبی و ناف قاعده ای جانبی است. (مظفریان. ۱۳۸۷).

۲-۱-۴-پراکنش جغرافیایی جنس درمنه

گونه های این جنس در اکوسیستم های بسیاری شامل صحرا (A.santolina)، محیط های مرطوب در نزدیکی سطح دریا تا ارتفاعات بالا در حدود ۴۰۰۰ متر (A.melanolepis) رشد می کنند. برخی گونه ها نظیر A.vulgaris در مناطق پوشیده شده از مواد پوسیده و فاسد رشد می کنند .(Cox and Moore 2010)

گونه های درمنه به طور گسترده ای در نیمکره شمالی، (معمولاٌ در زیستگاههای خشک و نیمه خشک) پراکنده شده اند، اما در نیمکره جنوبی تنها در حدود ۱۰ گونه از این جنس یافت شده است (Hayat, Ashraf et al. 2009).

۲-۱-۵-گیاه شناسی گونه درمنه خزری (Artemisia annua)

گیاه درمنه خزری دارای ساقه منفرد به ارتفاع تا ۱۲۰ سانتیمتر با برگ های بدون کرک یا با کرک های پراکنده، برگ های ساقه ای ۲ بار شانه ای بخش، دمبرگ دار با قطعات اصلی جدا از یکدیگر، قطعات شانه ای بخش یا شانه ای منقسم با لوب های سر نیزه ای دندانه دار یا کامل، محور برگ عریان یا با دندانک های کم، برگ های بالای ساقه و لابه لای ساقه ها به تدریج کوچک شده، برگ های روی شخه های گل آذین بسیار کوچک و با تقسیمات خطی تا نخی است. گل آذینها پانیکول گسترده با شاخه های بلند، مورب تا تقریباٌ افقی گسترده دارند.

گل های کناری ماده و زمان گلدهی و میوه دهی در اواخر تابستان تا اواسط پائیز است. رویشگاه گیاه در ایران: شمال، غرب، مرکز و شمال شرق است.

شکل ۲-۲: A. annua

۲-۱-۶-تاریخچه نامگذاری

درمنه از دوران گذشته در طب سنتی دارای اهمیت و مصارف گوناگون بوده است و از آنها با نامهای درمنه، افسنطین، یوشان، برنجاسف، قیصوم و ترخون نام برده شده است و این نامها امروزه نیز در اکثر مناطق متداول است (مظفریان، ولی ا…، ۶۸-۱۳۶۷)

نام Artemisia اولین بار در سال ۱۷۵۳ میلادی توسط لینه برای این جنس انتخاب شد. اقتباس این نام به افتخار زنی است که حدود ۳۲۵ سال قبل از میلاد مسیح می زیسته و همسر حاکم وقت (مازلوس) قسمتی از یونان بود. وی داروساز و گیاهشناس بوده و چندین گیاه را نیز نامگذاری کرده بود.

درمنه، یوشان، ترخ (terekh) این جنس در ایران ۳۴ گونه گیاهی علفی یکساله و چندساله دارد که در سراسر ایران پراکنده اند. گونه های انحصاری آن در ایران عبارتند از A. kermanensis و A.melanolepis و دیگر گونه های آن علاوه بر ایران در قفقاز، سیبری، ترکمنستان، افغانستان، پاکستان، آسیای مرکزی، ارمنستان، آناتولی، عراق، هیمالیا، تبت و اروپا نیز می رویند. پراکندگی جغرافیایی درمنه به وسعت ایران بوده از دشت های پست ساحلی تا ارتفاعات کوهستانی می رویند (مظفریان، و. ۱۳۸۶).

۲-۱-۷- ترکیبات شیمیایی سرده درمنه

مونوترپن های بدون حلقه^[۱۶] ، هیدروپراکسید مونوترپن ها^[۱۷] ، گلیکوزید مونوترپن های حلقه دار^[۱۸] و مونوترپن های غیر معمول در برخی از گونه های درمنه در ایران یافت شده اند (راستیان و مسعودی, ۲۰۱۱).

مهم ترین ترپن در گیاهان سرده آرتمیزنین می باشد که یک سزکویی ترپن لاکتون است. این ترکیب عمدتاٌ در بخش هوایی گیاه یافت می شود (Olofsson, Engstrom et al. 2011).

در سال ۲۰۰۸ در مطالعه ای بر روی A.scoparia، ۲۴ مونوترپن، ۱۹ سزکویی ترپن و ۲ کتون در این گیاه شناسایی شد (Singh, Mittal et al. 2009).

روغن فرار^[۱۹] درمنه اغلب حاوی بیش از ۱۰۰ ترکیبجداگانه^[۲۰] می باشد، به عنوان مثال در A.siberi بیش از ۱۶۰ ترکیب شیمیایی شناسایی شده است (Rustaiyan and Masoudi 2011).

عمده ترین ترکیبات موجود در روغن بدست آمده از برگ و گل این گیاه شامل : کامفور^[۲۱] ، -۱,۸ سینئول^[۲۲]، آلفا ترپینولن^[۲۳]، آلفا ترپینن^[۲۴] می باشد (Movafeghi, Djozan et al. 2010). گیاهان این رده حاوی ترکیبات گلیکونی متعدد هستند. در تعدادی از گونه های این گیاه ۸۰ آگلیکون آزاد^[۲۵] شناسایی شده است (Al Hazimi and Basha 2011).

در سال ۲۰۱۰ طی مطالعات صورت گرفته، ۱۸ ترکیب پلی فنلی^[۲۶] در برگ های این گیاه شناسایی شد (Carvalho, Teixeira et al. 2011).

در مطالعه ای که بر روی ۱۳ گونه درمنه صورت گرفت اسیدهای چرب غیر اشباع^[۲۷] غالب در تمام گونه های درمنه آلفا لینولنیک اسید (ALA) و لینولئیک اسید (LA) تشخیص داده شد (Carvalho, Teixeira et al.2011).

۲-۱-۸- خواص دارویی سرده درمنه:

ترکیبات فنلی بدست آمده از درمنه به عنوان یک مهار کننده پمپ با قابلیت هدف قرار دادن سیستم های جریان^[۲۸] در ساختار دیواره باکتریهای گرم مثبت پاتوژن انسانی شناخته شده اند. بررسی های اخیر نشان می دهند که کلرژنیک اسید^[۲۹] بدست آمده از A. absinthium دارای خواص ضد میکروبی است (Fiamegos, Kastritis et al. 2011).

کامفور یکی از اجزاء عمده اسانس درمنه است و ار آن در شیمی لاستیک سازی و کاغذ سازی، عطرسازی، لوازم آرایشی، صابون سازی، صنایع چسب، مواد افزودنی، روان کننده، ترکیب رزین ها، حلالها، پلاستیک و رنگها نیز استفاده می شود ۲۰۰۹)، محسن و علی).

۸و ۱ – سینئول به طور گسترده در تهیه مواد دارویی کاربرد دارد. به طور موضعی بعنوان داروی بی حس کننده و ضد عفونی کننده در درمان تورم بکار میرود. سینئول در اسپری های خانگی ، داروهای شستشو و در انواع روغن های پوست و مو مصرف می شود . در مقابل حشرات اثر کشندگی دارد و در تهیه عطر و مواد خوشبو کننده نیز بکار میرود (عبدی و همکاران. ۲۰۱۰).

لیمونن در فراورده های دارویی نظیر قرص بی کربنات سدیم و پمادهای ضد عفونی کننده وارد می شود.در ساخت ویتامین A، نیز از لیمونن استفاده می شود (ایوقی، برزگر و همکاران. ۲۰۱۱).

آرتمیزین برای درمان مالاریا ، عفونتهای انگلی مانند شیستوزوماسیس مورد استفاده قرار میگیرد.این ترکیب همچنین خواص ضد سرطان قوی و گسترده ای را در خطوط سلولی و مدلهای حیوانی نشان داده است(Krishna, Bustamante et al 2008).

اسانس های موجود در گونه های مختلف درمنه در فعالیت های بیولوژیکی مختلفی نقش دارند. فعالیت های بیولوژیکی بعضی از این اسانس ها به طور مستقیم به وسیله بشر تجربه شده است. به عنوان مثال، توجن (Thujone) یک مونوترپن شاخص در بعضی گونه های Artemisia است که باعث ایجاد مسمومیت مزمن می شود. به طوریکه تهیه نوشابه های الکلی از عصاره ریشه گیاه A.absinthium به خاطر وجود این ماده در چندین کشور خارجی ممنوع شده است (۱۴ مقاله). مقدار کل توجن (مشتقات ß-thujone و α) ممکن است تا بیش از ۶۰ درصد کل مقدار اسانس نیز برسد. همچنین ماده تلخ Absinthin استخراج شده از A.absithium خاصیت از بین بردن حشرات و لارو آنها را دارا می باشد.

طی تحقیقاتی که روی ۲۴۰ گونه از تیره Asteraceae جهت تعیین خواص داروئی آن انجام شد، حدود ۸۴ ترکیب دارویی در گونه های Artemisia تشخیص داده شده است. مهمترین گروهسزکویی ترپن ها یافت شده در قبیله Anthemideae شامل لاکتونهای سزکویی ترپن^[۳۰] می باشند. این مولکولها به طور وسیعی در طی تحقیقات کموتاکزونومیک (Chemotaxonomic) و سایر مطالعات در جنس Artemisia مورد تحقیق قرار گرفته اند. در حالیکه germacranolides و guaianolides ترکیبات غالب در این قبیله هستند، santanolides به طور اختصاصی در جنس Artemisia گزارش شده است.

گیاه A.annua منبع یک داروی مهم گیاهی سنتی در چین به نام Qing Hao است که در حدود بیش از ۲۰۰۰ سال به عنوان داروی کاهنده تب استعمال می شده است. ترپنوئیدها و فلاونوئیدهای متعدد استخراج شده از A.annua فعالیت ضد سلولی^[۳۱] مهمی را در هنگام آزمایش روی تومور در انسان نشان داده است. در بین این مواد، آرتمیزین (Artemisine) و کورستاژتین (Quercetagetin) به عنوان ماده موثر در این فعالیت ضدسلولی مهم اثبات شده اند (۱۷ مقاله). همچنین عصاره های استخراج شده از قسمت های هوایی گیاه A.annua که در مجاورت هوا خشک شده اند، دارای فعالیت تعدیل مصونیت از طریق تکثیر لنفوسیت نوع T بوده اند. بر اساس مطالعات انجام شده ۲۴ ترکیب در اسانس گونه A.annua مشاهده شده است. ترکیبات اصلی این اسانس، آرتمیزیا کتون، ۱و۸- سینئول، پینوکاروون، بتا–سلینن، کامفور و گاما- مورولن می باشند) مینا ربیعی، ۱۳۸۲).

در کشور مجارستان ترکیب های اصلی اسانس گیاه A.annua، آرتمیزیا کتون (Artemisia ketone) و آرتمیزیا الکل (Artemisia alcohol) گزارش شده اند.

ترکیب های اصلی اسانس A.annua رشد یافته از بذور کشور چین شامل آرتمزیا کتون (Artemisia ketone) و آرتمیزیا الکل (Artemisia alcohol)، میرسن (Myrcene)، آلفا – گواین (α- guaiene) و کامفور (Camphor) می باشند. ترکیبهای اصلی اسانس A.annua رشد یافته از بذور کشور ویتنام، کامفور (Camphore) و جرماکرن- دی (germacrene – D) می باشد. بر اساس تحقیقات انجام شده روی اسانس گیاه A.annua در شمال ایران، می توان ترکیبات آرتمیزیا کتون و کامفور را به عنوان ترکیبات اصلی در این گیاه نام برد.

ترکیب شیمیایی بورنئول که تنها در گونه A.annua مشاهده شد، به طور گسترده برای خوشبو کردن انواع محصولات بهداشتی و فراورده های پزشکی استفاده می شود. ترکیب شیمیایی بتا کاریوفیلن که در گونه های A.annua و A.scoparia موجود بوده است، به عنوان طعم دهنده در ادویه، صابون و صمغ آدامس به کار می رود.

یکی از مهمترین ترکیبات دارویی این گیاه، آرتمیزینین^[۳۲] از گروه متابولیت های ثانویه موسوم به لاکتون سزکویی ترپن اندوپراکسیدها می باشد که فعالیت مؤثری را برعلیه نژادهای انگل پلاسمودیوم^[۳۳] عامل بیماری مالاریا از خود نشان می دهند. از آنجا که در گزارشات سازمان بهداشت جهانی موارد مقاوم این انگل به داروهای فعلی نظیر کلروکوئین، سولفادوکسین و پرپمتامین یافت شده، به همین دلیل تولید تجاری و انبوه آن مورد توجه خاصی قرار گرفته استKalyman , D. L. 1985)). عملکرد نسبتاٌ کم [۰۸/۱ – ۰۱/۰ درصد] این ماده در گیاه محدودیت عمده ای در تولید تجاری آن است. تغییرات در شرایط کشت و محیط رشد در کشت های سلولی و تغییر سطوح هورمون های رشد در کشت بافت به منظور بالا بردن مقدار آرتمیزنین چندان موفق نبوده است و از طرف دیگر به دلیل منابع محدود و مشکلات ساخت مصنوعی – شیمیایی این ماده مورد توجه قرار نگرفته است. به همین دلیل در سالهای اخیر تلاش های زیادی برای افزایش آرتمیزنین از گیاه فوق به کمک الیسیتورها صورت گرفته است(Archana, G. et al. 2002).

تحقیقات جدید در سال ۲۰۰۵ نشان دادند که آرتمیزنین به تنهایی قادر به از بین بردن انتخابی سلولهای سرطانی است. برای مثال مشتقات آرتمیزنین دارای فعالیت ضدتوموری بر علیه سلولهای سرطانی سینه انسان با اثر کشندگی انتخابی می باشند (Singh, N.P. and H .Lai .2001). خاصیت آللوپاتیک (دگر آسیبی در گیاهان) و دورکنندگی حشرات نیز از دیگر اثرات این گیاه است ( Duke, S. et al. 2002).

۲-۲-متابولیت های ثانویه

بشر در طول قرن ها به گیاهان به عنوان منبع کربوهیدرات، پروتئین و چربی وابستگی کامل داشته است. علاوه بر این گیاهان منبع طیف وسیعی از متابولیت های ثانویه می باشند (Ravishankar G. et. Al.). عمدتاٌ یکسری از واکنش های شیمیایی که واسطه آنزیمی دارنددر گیاه زنده به عنوان متابولیسم شناخته می شوند. این واکنش های شیمیایی با هم هماهنگ شده تا مسیرهای متابولیکی که در آنها سنتز مولکولهایی مثل قندها، اسیدهای آمینه، اسیدهای چرب عمده، نوکلئوتیدها و پلیمرهای حاصل از آنها (DNA,RNA) انجام می شود بدست بیایند. این تجمع به عنوان متابولیسم اولیه در نظر گرفته می شود و ترکیب تولید شده که برای زنده ماندن و سالم ماندن گیاه لازم هستند متابولیت اولیه^[۳۴] نامیده می شوند. همچنین در گیاهان، مسیرهای متابولیکی دیگری وجود دارد که محصول این مسیرها برای موجود کاملاٌ مشخص نیست که به این ترکیبات متابولیت های ثانویه اطلاق می شود و به مسیر تولید آنها متابولیسم ثانوی گویند. تولید متابولیت های ثانویه بخشی از سیستم دفاعی گیاه را تشکیل می دهد. گرچه محصولات ثانویه گیاهی در گذشته به صورت ترکیبات شیمیایی تعریف می شدند که دارای نقش بیوشیمیایی حیاتی در ساختار و حفظ سلول گیاهی نیستند، تحقیقات اخیر نشان داده که این ترکیبات دارای نقش های حیاتی در اکوفیزیولوژی گیاهان هستند. مسیرهای متابولیکی بخشی از برنامه تکاملی به حساب می آیند و در حقیقت متابولیسم ثانویه نشانه تمایز سلول است و تشکیل متابولیت های ثانویه نشانه اختصاصی شدن سلول هاست (Ram G, Bhan M. et al. 2005).

سه گروه از محصولات ثانویه بر اساس ویژگی های بیوسنتزی وجود دارند. محصولات گیاهی بر اساس نحوه بیوسنتز به ترپن ها، فنلیک و ترکیبات ازت دار تقسیم می شوند. شکل ۱-۴ مسیرهای بیوسنتز محصولات ثانویه و اثرات متقابل آنها با متابولیسم اولیه را به شکل ساده نشان می دهد (کافی و همکاران. ۱۳۸۲).

شکل ۲-۳- نمای ساده ای از مسیرهای عمده بیوسنتز محصولات ثانویه و ارتباط آنها با متابولیسم اولیه

۲-۲-۱- ترپن ها^[۳۵]

ترپن ها یا ترپنوئیدها بزرگترین گروه محصولات ثانویه را شامل می شوند. مواد متنوع این گروه معمولاٌ در آب غیر محلول بوده و به وسیله منشاء بیوسنتزی مشترکشان به هم می پیوندند. ترپن ها از امتزاج واحدهای ۵ کربنی شکل می گیرند که از مسیر موالونیک اسید ساخته می شوند. این مواد سمی هستند و در بسیاری گیاهان به عنوان ترکیبات گیاهی ضد گیاه خواری ایفای نقش می کنند. مثال هایی از انواع ترپن ها عبارتند از: منوترپن ها^[۳۶]، سزکویی ترپن ها^[۳۷]، دی ترپن ها^[۳۸]، تر ترپن ها^[۳۹] و پلی ترپن ها^[۴۰] (کافی و همکاران. ۱۳۸۲).

۲-۲-۲- ترکیبات ازت دار^[۴۱]

در ساختمان بسیاری از محصولات ثانویه گیاهان ازت وجود دارد. ترکیباتی که در این گروه جای گرفته اند دارای خواص دارویی بوده و بسیار مورد علاقه واقع شده اند (کافی و همکاران. ۱۳۸۲).

۲-۲-۳- ترکیبات فنلی^[۴۲]

گیاهان طیف وسیعی از محصولات ثانویه را تولید می کنند که این ترکیبات دارای یک گروه فنلی می باشند. این ترکیبات به نام ترکیبات فنلی طبقه بندی می شوند. با توجه به تنوع شیمیایی آنها، ترکیبات فنلی نقش های متفاوتی را در گیاهان بازی می کنند. در گیاهان اکثر ترکیبات فنلی از فنیل آلانین و تیروزین مشتق شده اند (کافی و همکاران. ۱۳۸۲).

۲-۲-۳-۱- فلاونوئیدها

فلاونوئیدها گروه بزرگی از ترکیبات فنلی و پانزده کربنه گیاهی به همراه دو حلقه آروماتیک (توسط یک پل سه کربنی به یکدیگر متصل می شوند) را تشکیل می دهد این ساختمان از دو مسیر بیوسنتزی جداگانه ایجاد می شود. پل و یک حلقه آروماتیک (حلقهB)، یک واحد فنیل پروپان هستند که از طریق فنیل آلانین ساخته شده در مسیر اسید شیکمیک، ساخته می شوند. شش کربن حلقه آروماتیک دیگر (حلقه A) از سه واحد استات و از طریق مسیر اسید مالونیک نشأت گرفته اند (شکل ۱-۵). فلاونوئیدها موجب انواع اعمال فیزیولوژیکی و اکولوژیکی مختلف در گیاهان می شوند و به عنوان بزرگترین گروه ترکیبات حلقوی اکسیژن دار شناخته شده اند (Kubasek et.al. 1992).

۲-۴- اسکلت پایه فلاونوئید

فلاونوئیدها براساس درجه اکسیداسیون پل سه کربن، به گروه های مختلفی مثل آنتوسیانین ها، فلاون ها، فلاونل ها و ایزوفلاونوئیدها تقسیم می شوند.

آنتوسیانین ها، فلاونوئیدهای رنگی موجود در گل ها و میوه ها هستند که نور ماوراء بنفش را جذب کرده و گیاه را از صدمه توسط این اشعه محافظت می کنند. ایزوفلاونوئیدها گروهی از فلاونوئیدها هستند که به عنوان مواد ضد قارچی و باکتری عمل می کنند. تانن ها ترکیبات پلیمری فنلی هستند که نقش ممانعت از تغذیه گیاه خواران را بر عهده دارند. فلاونوئیدها اعمال مختلفی مانند رنگی شدن و دفاع را در گیاه به عهده دارند (کافی و همکاران. ۱۳۸۲).

۲-۲-۴- نقش متابولیت های ثانویه در گیاهان مولد

متابولیت های ثانویه گروه بزرگی از ترکیبات طبیعی گیاهان را تشکیل می دهند. تنوع شگفت انگیز ساختار شیمیایی ترکیبات ثانوی نتیجه تلاش گیاهان برای ایجاد سازگاری با محیط غیر ثابت و تنش زای اطراف آنها است. به عبارت دیگر این ” تجهیزات شیمیایی” مانع رسیدن آسیب به گیاهان توسط ویروس ها، باکتری ها، قارچ ها یا علف خوار ها می شوند و رقابت آنها با سایر گیاهان را به حداقل می رسانند (Sudha G. et.al 2002). متابولیت های ثانویه از نظر بیولوژیکی و فیزیولوژیکی جزء ترکیبات فعال محسوب می شوند. به طور کلی نقش متابولیت های ثانویه را می توان در موارد ذیل خلاصه کرد:

1. جلوگیری از مسمومیت سلول ها توسط برخی ترکیبات حاصل از متابولیسم اولیه
2. اعمال برخی اثرات فیزیولوژیکی در بدن موجودات هدف
3. به عنوان پیام رسان های شیمیایی به منظور هماهنگ سازی متابولیسم در اندام های مختلف و هماهنگ ساختن فعالیت گیاهان مختلف در بدن یک گونه مشابه
4. توسعه پایدار اکولوژیکی (اصغری، غ ر. ۱۳۸۵).

۲-۲-۵- بازار جهانی گیاهان دارویی و معطر

اگرچه طب نوین مستلزم بکارگیری داروهای سنتزی و عوامل میکروبی است سهم عمده ای از صنعت دارویی جهان به منابع گیاهی اختصاص دارد. در حال حاضر بیش از یک چهارم دارو های تجویزی مورد استفاده در کشورهای توسعه یافته به طور مستقیم و غیر مستقیم (نیمه سنتزی) از گیاهان مشتق می شود و فروش سالانه این داروها تنها در کشور امریکا در سال ۲۰۰۲ به بیش از ۳۰ میلیارد دلار بوده است (Fower M. et.al. 2006). از سوی دیگر در کشورهای در حال توسعه از قبیل چین و هند سهم داروهای موجود در بازار به حدود ۸۰ درصد نیز می رسد، مطابق آمارهای موجود ارزش تجاری فراورده های گیاهی در مقایسه با داروهای شیمیایی (با رشد سالانه ۳ تا ۶ درصد) از رشد سالانه ۵ تا ۱۵ درصد برخوردار است و تخمین زده می شود که بازار جهانی این فراورده ها تا سال ۲۰۵۰ به ۵ تریلیون برسد (نوریان، ا. و بشیری صدر، ز. ۱۳۷۹).

۲-۳-معرفی ساختار آرتمیزینین به عنوان یک ترپن مهم

به لحاظ ساختار شیمیایی ،آرتمیزینین یک سزکویی ترپن حاوی یک پل پرکسید غیر معمول است.اعتقاد بر این است که این پراکسید مسئول مکانیزم عمل این ترکیب به عنوان یک ترکیب دارویی می باشد.هیچ ترکیب طبیعی دیگری با چنین پل پرکسید شناخته نشده است. (Eckstein-Ludwig, Webb et al 2003).

اعتقاد بر اینست که بیوسنتز آرتمیزینین از مسیر موالونات (MVA) صورت میگیرد.روشن نیست که آیا مسیر غیر موالونات نیز میتواند با بهره گرفتن از پیش سازهای ، ایزو پنتنیل پیرو فسفات (DMAPP) به بیوسنتز این سزکویی ترپن بپردازد یا خیر(Sawai and Saito 2011).

در مسیر بیوسنتر این ترکیب ، د هیدرو آرتمیزینیک اسید به عنوان پیش ماده نهایی به آرتمیزین تبدیل میشود(Wallart , Pras et al .1999).

شکل۲-۵: مسیر بیوسنتز آرتمیزنین Famesyl diphosphate

۲-۴- کشت بافت گیاهی

۲-۴-۱- طرز تهیه ریزنمونه گیاهی

۲-۴-۱-۱- انتخاب ریزنمونه

ریزنمونه می تواند اندام (ریشه، ساقه، برگ، گل، بذر و پیاز)، بافت (مریستم، پارانشیم) یا سلول (میکروسپور) باشد. ساده ترین نوع کشت، کشت اندام است مانند قلمه ساقه تک گرهی، گل کامل و سخت ترین نوع کشت، کشت سلول در محیط کشت مایع است. ریزنمونه باید از گیاه مادری تهیه شود که عاری از بیماری، دارای برنامه تغذیه مناسب و شبیه به گیاه مادری بوده و در گلخانه یا اتاقک رشدکه دارای شرایط محیطی مناسب است پرورش یافته باشد.

۲-۴-۱-۲- تأثیر مواد گیاهی و عوامل فیزیکی در رشد ریزنمونه

مواد گیاهی می تواند بر رشد و نمو ریزنمونه مؤثر باشد. گیاهان دو لپه ای نسبت به تک لپه ای به محیط درون شیشه اندامهای مختلفی تولید in vitro ای واکنش مثبت تری نشان می دهند. به طور کلی گیاهانی که در محیط می کنند، اگر در محیط درون شیشه ای کشت شوند نیز چنین اندامهایی را تولید می کنند.

سن گیاه نقش تعیین کننده ای را در واکنش ریزنمونه در محیط درون شیشه ای دارد. معمولاً بافتهای جنینی قدرت تکثیر بالاتری نسبت به بافتهای مسن دارند. بافتهای علفی و غیر خشبی نسبت به بافتهای خشبی واکنش مثبت تری نشان می دهند. به طور کلی اندامهای رویشی نسبت به اندامهای زایشی راحت تر تکثیر می شوند.

ریزنمونه ها پس از کشت در اتاقک رشد قرار داده می شوند. در اتاقک رشد ۱۶ ساعت نور و ۸ ساعت تاریکی تنظیم می گردد. البته بهترین دوره نوری برای ریزنمونه در محیط درون شیشه ای همان دوره نوری است که برای گیاه مادری مناسب است. در مورد بافت های بدون کلروفیل نیازی به وجود نور نیست، در صورتیکه ریزنمونه های کلروفیل دار جهت انجام فتوسنتز نیاز به نور دارند. برخی به غلط تصور می کنند که ریزنمونه در محیط درون شیشه در ظروف Co _۲ در داخل ظرف کشت کم است، در حالیکه میزان Co ای به شدت نور کم نیاز دارد و میزان _۲کشت به اندازه کافی وجود دارد. منبع تأمین نور در اتاقک کشت لامپهای فلورسنت هستند.

دما از دیگر عوامل مهم در اتاقک رشد می باشد. اکثر ریزنمونه های گیاهی در دمایی حدود ۲۵ درجه سانتیگراد به خوبی رشد می کنند. البته گیاهان گرمسیری به دمای بالاتر (۲۹-۲۸ درجه سانتیگراد) و گیاهان پیازی به دمای کمتری (۱۸ درجه سانتیگراد) نیاز دارند.

رطوبت نسبی اتاقک رشد نیز از عوامل مؤثر در رشد ریزنمونه است. معمولاً رطوبت نسبی اتاقک رشد بین ۵۰-۴۰ درصد تنظیم می شود. افزایش رطوبت موجب افزایش آلودگی های قارچی و کاهش آن موجب از دست رفتن آب ریزنمونه می شود.

تهویه مناسب و تأمین اکسیژن عامل مهم رشد سلولها و بافتها است. به همین جهت در صورتی که محیط کشت، مایع باشد باید آن را روی شیکر قرار داد و یا با بهره گرفتن از کاغذ صافی و ایجاد پل کاغذی، اکسیژن محیط کشت را تأمین نمود. در محیطهای کشت جامد با قرار دادن غیر قطبی ریزنمونه (به صورت وارونه) می توان اکسیژن مورد نیاز را تأمین نمود.

چون در محیط درون شیشه ای شدت نور کم و در نتیجه فتوسنتز پایین است، نیازی به افزودن Co₂وجود ندارد

ومعمولاً بیشتر نیازگیاه به هیدرات کربن از طریق افزودن ساکارز تأمین می شود.

۲-۴-۲- روش های مختلف کشت بافت گیاهی

کشت بافت گیاهی که انواع روش های کشت گیاهان در شرایط استریل را تحت پوشش قرار می دهد، بایستی در موارد خاص استفاده شود و تقسیم آن به انواع مختلف کشت امکان پذیر است که عبارتند از:

1. کشت بذر^[۴۳] کشت بذور درون شیشه به منظور تولید گیاهچه یا گیاه کامل.
2. کشت جنین^[۴۴] کشت جنین جداشده از بالغ یا نابالغ.
3. کشت اندام^[۴۵] کشت اندام های جداشده گیاهی، که به انواع مختلفی از جمله، کشت در سیستم نوک، کشت ریشه و کشت دانه گرده قابل تقسیم است.
4. کشت کالوس^[۴۶] کشت یک بافت تمایز یافته از ریزنمونه و اجازه دادن به آن برای تمایز زدایی و تشکیل بافت کالوس.
5. کشت سلول^[۴۷]کشت سلول های جداشده و یا توده های خیلی کوچک سلولی که در محیط مایع پراکنده می باشد.
6. کشت پروتوپلاست^[۴۸] کشت پروتوپلاست های گیاهی، یعنی سلول های فاقد دیواره.

۲-۴-۳- کشت کالوس

۲-۴-۳-۱ کالوس

کالوس یا پینه توده سلول پارانشیمی تمایز نیافته است. کالوس می تواند در واکنش به زخم، در محل بافتهای توموری، در محل جوش خوردن پیوند یا در محیط درون شیشه ای تولید شود. کالوس می تواند در تهیه پروتوپلاست، تولید جنین سماتیک، تولید اندامهای ریشه و ساقه و تولید متابولیت های ثانویه مورد استفاده قرار گیرد. برگ، اندام ذخیره ای (پیاز،غده)، گل و میوه از اندامهایی هستند که می توانند برای تولید کالوس مورد استفاده قرار گیرند. از جمله بافتها می توان به بافتهای پیش آوندی، مزوفیل برگ، لپه ها، دایره محیطیه ریشه و لایه آوندی اشاره کرد. معمولاً تشکیل کالوس در گیاهان دو لپه ای بیشتر از گیاهان تک لپه ای است. محیط کشت پایه که غنی از نیتروژن به خصوص نیترات و آمونیوم و فسفات است،LS تغییر یافته و محیط کشتMS یا MSتغییر یافته برای تولید کالوس مورد استفاده قرار می گیرد.

برای تولید کالوس قند های ساکارز یا گلوکز به مقدار ۴-۲ درصد (۴۰-۲۰ گرم در لیتر محیط کشت) به کار می رود. اسیدهای آمینه گلیسین و آرژنین تأثیر مثبتی بر تولید کالوس دارند، همچنین کازئین هیدرولیز شده به محیط کشت اضافه می شود. تنظیم کننده های رشد از جمله اکسین ها و سیتوکنین ها نقش به سزایی در تولید کالوس دارند. غلظت متوسط تا بالای اکسین ها از جمله اسید نفتالین استیک، اسید ایندول استیک و ۲,۴-D برای تولید کالوس ضروری است. از جمله سیتوکنین ها می توان به کینتین و بنزیل آدنین اشاره کرد که با غلظت کمتری نسبت به اکسینها، مورد استفاده قرار می گیرد.

محیط کشت جامد برای کشت کالوس دارای معایبی به شرح ذیل است:

1. در محیط کشت جامد، توده کالوس در سطح محدودی با محیط کشت در تماس است، در نتیجه مواد کمتری از محیط کشت جذب می کند و تعادلی در رشد در اثر مواد غذایی جذب شده، گازهای تبادل شده و فرآورده های پس مانده سمی بین کالوسو محیط کشت وجود ندارد.
2. در محیط کشت جامد تأمین اکسیژن کمتر از محیط کشت مایع است.
3. توده های کالوس در محیط کشت مایع به قطعاتی تقسیم می شوند و در سطح بیشتری تولید می شوند، در نتیجه جذب مواد غذایی از محیط کشت افزایش می یابد که در محیط کشت جامد چنین نیست.
4. در محیط کشت جامد، افزودنیهایی وجود دارد که باعث تسریع در تمایز می شوند و از رشد کالوس جلوگیری می کنند.

واکشت کالوس یعنی انتقال کالوس از یک محیط کشت به محیط کشت دیگر که به دلایل زیر صورت می گیرد:

1. تجمع مواد زائد در محیط کشت.
2. تخلیه مواد غذایی محیط کشت.
3. خشک شدن محیط کشت.

معمولاً اگر دمای اتاق رشد حدود ۲۵ درجه سانتیگراد باشد هر ۶-۴ هفته یکبار لازم است کالوس به محیط جدید منتقل شود. کالوس ها پس از واکشتهای مکرر قادر به تأمین اکسین و سیتوکنین بوده و از این نظر خودکفا می شوند که به آن عادت کردن می گویند.

کالوسها از نظر رنگ و برخی صفات دیگر می توانند متفاوت باشند.کالوس ها از نظر رنگ به دو دسته تقسیم می شود: کالوس های تیره که دارای سایه های کرم، زرد، بژ یا قهوه ای می باشند و کالوسهای روشن که گاهی اوقات (نه همیشه) سبز هستند و ممکن است دارای رنگدانه های قرمز (آنتوسیانین) یا تیره (ترکیبات فنولی) باشند.

از نظر بافت نیز کالوس ها متفاوت بوده و برخی نرم و براحتی قابل جدا کردن هستند (کالوس هویج) و برخی سفت و محکم هستند (کالوس آنتوریوم). از نظرسرعت رشد نیز، کالوس ها متفاوتند و معمولاً بعد از گذشت یک تا چند هفته مقدار کالوس قابل مشاهده است. معمولاً مدت زمان دوبرابر شدن یک توده کالوس مستقر شده یک هفته یا بیشتر می باشد.

شاخص های متعددی برای ارزیابی کالوس ها وجود دارندکه از جمله آنها می توان به وزن تر، درصد وزن خشک، شمارش تعداد سلول، شاخص میتوزی کالوس و شاخص تنفس کالوس اشاره کرد.

۲-۴-۴- هورمونهای گیاهی

۲-۴-۴-۱- اکسین ها

اکسین برای القای رشد و طویل شدن در سلول و به شکل متداول برای ریشه زایی مورد استفاده قرار می گیرد.متداول ترین اکسین ها عبارتند از ۴،۲ دی کلرو فنوکسی استیک اسید (۲,۴-D)، نفتالین استیک اسید (NAA)، ایندول استیک اسید (IAA)، ایندول ۳- بوتیریک اسید (IBA).

IAA نوعی اکسین طبیعی است در حالی که ۲,۴-D، NAA و IBA اکسین های مصنوعی هستند.IAA در حضور نور به شدت تجزیه می شود در حالی که اکسین های مصنوعی به شدت پایدارند. دایکامبا^[۴۹]و پیکلورام^[۵۰] نیز اکسین های مصنوعی هستند. دایکامبا برای تک لپه ایها و پیکلورام برای بقولات استفاده می شود.

۲-۴-۴-۲- سیتوکنین ها

ترکیبات اکسین به طور متداول در ترکیب با سیتوکنین، یعنی گروهی از تنظیم کننده های رشد که تقسیم سلولی و ساقه زایی را تشدید می کنند، مورد استفاده قرار می گیرند. ایزوپنتیل آدنین، ۶ فوروفوریل آدنین که کینتین نیز نامیده می شود و بنزیل آدنین (BA) متداول ترین سیتوکنین ها در محیط کشت بافت گیاهی هستند. زئاتین و زئاتین ریبوزید دو سیتوکنین گران قیمت بوده و برای کشت های بافت گیاهی و سلولهای ویژه ای کاربرد دارند. تیدیازورون اخیراٌ با موفقیت برای پیشبرد باززایی گونه های چوبی مورد استفاده قرار گرفته است. با اعمال تغییراتی در نوع و غلظت نسبی اکسین ها و سیتوکنین ها در محیط کشت، امکان القای رشدهای تمایز نیافته و با ریخت زایی فراهم می گردد (Archana, G. 2002).

۲-۴-۴-۳- جیبرلین ها

جیبرلین ها طویل شدن ساقه را در چند گونه گیاهی تشدید می کنند و برای طویل شدن ساقه، پس از تشکیل جوانه در کشت بافت بعضی از گونه ها کاربرد دارد.

۲-۴-۴-۵- اسید آبسیزیک

اسید آبسیزیک بازدارنده رشد سلولی و القاگر خواب است اما احتمالاٌ تنظیم الگوی نموی را بر عهده دارد و نقش ویژه ای را در خلال مراحل اولیه جنین زایی رویشی ایفا می کند.

۲-۴-۴-۶- اتیلن

اتیلن ممکن است مانع رشد سلولی شود (Beyer, E. 1976) و روند پیری را در برخی کشت ها تسریع (Chen, D. 2000) و از تشکیل رویان جلوگیری می کند (Frame, B. 2000).

۲-۴-۵- اسیدهای آمینه، آگار، pHو منبع انرژی

در بین ترکیبات آلی که در محیط کشت به طور اختیاری اضافه می شوند اسیدهای آمینه برای افزایش رشد سلول و باززایی گیاه مورد استفاده قرار می گیرند (Beyer, E. 1976). محیط کشت MS می تواند حاوی گلایسین به عنوان یک منبع نیتروژنی احیایی باشد. گلوتامین نیز به عنوان تنها منبع نیتروژنی برای چند گونه گیاهی قابل استفاده است (Ghosh, B. 1997). آگار در غلظت های ۶/۰ تا ۸/۰ درصد به کار می رود و غلظت های بالاتر موجب کاهش وزن تر و خشک و میزان ساقه زایی در محیط های کشت می شود (Grant, J. 1991). تفاوت هایی که در جنین زایی مشاهده می شود می تواند ناشی از عوامل ژلاتینی و محیط مایع باشد. pH محیط معمولاٌ با HCl یا KOH تنظیم می گردد. اتوکلاو محیط عموماٌ آزادسازی قندهای اسیدی را در پی دارد که سبب نزول اندکی در pH محیط می شود (Hadarami, I. 1993).

متداول ترین منبع انرژی کربنی مورد استفاده در محیط های کشت سلول گیاهی ساکارز است اما گلوکز و فروکتوز هم مورد استفاده قرار می گیرند (Frame, et.al 2000).

۲-۴-۶- تمایز سلولی(Cytodifferentation)

سلولهای بافت کالوس طبیعت پارانشیمی دارند. در طی تمایز مجدد به یک گیاه کامل، این سلول ها بایستی به انواع مختلفی از سلول ها تمایز یابند. این تمایز مجدد در سلول ها به تمایز سلولی معروف است. در گیاه سالم تمایز بافت ها به روش ثابتی از خصوصیات اندام و گونه گیاه تداوم می یابد. معذالک کشت های کالوس از آنجا که فاقد عناصر آوندی هستند، برای مطالعه تأثیر انواع مواد شیمیایی و عوامل فیزیکی در تمایز بافت آوندی، سیستمی ارزشمند است. اکسین و ساکارز تأثیر عمده ای بر تمایز بافت های آوندی دارند، درحالیکه سیتوکنین ها و جیبرلین ها تمایز بافت آوند چوبی (Xylogenesis) را سرعت می بخشند. عموماٌ اکسین در غلظت پائین (۵/. میلی گرم در لیتر) تولید آوند چوبی را تحریک نموده و ارتباط معکوسی بین غلظت اکسین و میزان تمایز بافت آوند چوبی دارد. بعلاوه مشاهده شده است که تأثیر اکسیژن بر تمایز بافت آوندی به نحو تنگاتنگی به حضور قندها بستگی دارد. همچنین فاکتورهای فیزیکی نظیر دما و درجه حرارت تأثیر شناخته شده ای بر تمایز بافت آوندی دارد (فارسی، م. ج. ذولعلی. ۱۳۸۴).

۲-۴-۷- تمایز اندام

در طبیعت خاصیت توتی پوتنسی سلول های سوماتیکی در گیاهان مختلف دیده شده است. به طوریکه قطعات بزرگ ساقه و ریشه قادرند در اثر تمایز ساقه و ریشه تولید کنند. مطالعات در شرایط درون شیشه ای نشان داده است که خاصیت توتی پوتنسی به چند گونه اندک محدود نمی باشد و اغلب گونه های گیاهی اگر در شرایط مناسب قرار گیرند، تمایز نشان خواهند داد. برای باززایی یک گیاه کامل از یک سلول یا بافت کالوس، تمایز سلولی کفایت نمی کند و تمایز بایستی به شکل گیری جوانه ساقه یا جنین منجر شود. این امر با اندام زایی (Organogenesis) یا جنین زایی سوماتیکی تحقق می یابد. در اندام زایی، یک ساختار تک قطبی که متصل به بافت آوندی اولیه در درون کالوس است تشکیل می شود ولی در جنین زایی یک ساختار دو قطبی بدون هیچ گونه اتصال آوندی با بافتکالوس مادری یا ریزنمونه شکل می گیرد (فارسی، م. ج. ذولعلی. ۱۳۸۴).

۲-۴-۷-۱- اندام زایی

در کشت بافت گیاهی اندام زایی فرایندی است که طی آن اندام های گیاهی نظیر ساقه، ریشه، جوانه گل و غیره تولید می شوند. این فرایند عبارت است از تولید اندام ها و جنین گیاهی (ساختارهای شبه جنین) از نقاطی غیرعادی نسبت به بافت مادری بر روی یک ریزنمونه سازمان یافته که فاقد هر سیستم از قبل تشکیل شده می باشد. ساقه ها و ریشه

های نابه جا از بافت هایی منشاء می گیرد که در حالت طبیعی این اندام ها را تولید نمی نمایند. ساقه های نابه جا ساختارهایی متشکل از ساقه و برگ هستند که از بافت های گیاهی در مکان هایی غیر از زاویه برگ منشاء می گیرند. نمو گیاه از طریق اندام زایی عبارت از تشکیل اندام ها با منشاء نابه جا یا منشاء مجدد می باشد. گیاه کامل باززایی شده با این روش، یک ساختار یک قطبی می باشد. این گیاه یک سری رشته های پروکامبیومی تولید می نماید که این رشته ها با شبکه آوندی موجود از قبل و گسترش یافته در بافت کالوس یا ریزنمونه کشت شده ارتباط برقرار می نماید.

فرایند اندام زایی از جنین زایی سوماتیکی متداول تر است و در تکثیر کلون به صورت انبوه پتانسیل خیلی بیشتری دارد و تولید گیاه به روش اندام زایی به دو طریق امکان پذیر است:

1. اندام زایی از بافت کالوس با منشاء مجدد
2. خروج اندام های نابه جا به طور مستقیم از ریزنمونه (فارسی، م. ج. ذولعلی. ۱۳۸۴).

۲-۴-۷-۲- اندام زایی از بافت کالوس

باززایی گیاه از ریزنمونه های کشت شده، مستلزم تولید کالوس های پایه و سپس تمایز جوانه ساقه از این بافت است. ایجاد ساقه، ریشه، گل آذین جوان، گلبرگ، جنین و … در شرایط درون شیشه ای صورت گرفته است. برای باززایی موفق گیاه در هر گونه و یا واریته معین ممکن است به ریزنمونه خاصی نیاز باشد. ریزنمونه های حاصل از اندام های بالغ و نابالغ را می توان در تهیه کالوس و سپس باززایی گیاه مورد استفاده قرار داد. با این حال معمولاٌ ریزنمونه های دارای سلول های فعال میتوزی، برای تولید کالوس مناسب تر هستند.

بافت ها و اندام های نابالغ در کشت درون شیشه ای از نظر مورفولوژیکی نسبت به بافت های بالغ انعطاف پذیرترند. اندازه و شکل ریزنمونه نیز مهم است.تعداد زیاد سلول در ریزنمونه های بزرگ تر، احتمال بدست آوردن یک کشت بادوام را افزایش می دهد. درصد کمی از سلول های ریزنمونه در تشکیل کالوس شرکت می نمایند. محل تشکیل کالوس معمولاٌ در سطح پیرامون ریزنمونه و یا در سطح بریده شده است. بافت کالوس در اثر ایجاد زخم و یا در پاسخ به هورمون های اضافه شده در محیط کشت ایجاد می شود.برای انتخاب ریزنمونه بایستی اندام های مریستمی نظیر نوک ساقه، جوانه جانبی، گل آذین، ساقه، برگ، دمبرگ و ریشه، بر سایر بافتها ترجیح داده می شود. چرا که این بافت ها دارای خصوصیات نظیر خصوصیات کلونی، بقاء کشت، سرعت رشد و خاصیت توتی پوتنسی در کشت های درون شیشه می باشد.مریستم ها، نوک ساقه و جوانه های جانبی، برگ ها و جنین های نابالغ، بویژه در غلات نیز ریز نمونه های خوبی هستند. ریزنمونه هایی نظیر برگ های بالغ، ریشه، ساقه، دمبرگ و اجزای گل، می توانند با موفقیت برای تولید گیاهچه به روش اندام زایی مورد استفاده قرار گیرند. فصل سال، سن و وضعیت فیزیولوژیکی گیاه والد نیز در موفقیت اندام زایی از کشت های سلولی سهیم اند. محیط کشت های مختلفی از جمله MS، B₅، وایت و محیط کشت SH برای اندام زایی مورد استفاده قرار می گیرند. محیط کشت MS بر خلاف محیط های دیگر، محتوی مقادیر زیادی نیتروژن آمونیومی می باشد.

در روش اندام زایی معمولاٌ از دو نوع کشت سلولی استفاده می شود:

1. کشت توده های سلولی در سطح محیط کشت جامد
2. کشت سوسپانسیون سلولی در محیط کشت مایع

غلظت مواد تنظیم کننده رشد در محیط کشت برای اندام زایی بسیار مهم است. اکسین با غلظت متوسط تا زیاد اولین هورمون مورد استفاده برای تولید کالوس است. غالباٌ از هورمون ۲,۴-D که اکسین بسیار نیرومندی است به تنهایی برای القاء کالوس استفاده می شود. در بعضی از گونه ها غلظت زیاد اکسین و غلظت کم سیتوکنین در محیط کشت روند تولید کالوس را ترقی می دهد. سیتوکنین های مورد استفاده کینتین یا بنزیل آدنین می باشند. بافت کالوس متشکل از گستره وسیعی از انواع واکوئل دار با تمایز نامنظم است که تعداد کمتری سلول های مریستمی در بین آنها پراکنده می باشد. ماهیت بافت کالوس به بافت ریزنمونه و یا بافت هایی که ریزنمونه از آن منشاء گرفته است و همچنین ترکیب محیط کشتی که برای تولید و نگهداری آن به کار می رود، بستگی دارد. کالوس را می توان با تهیه واکشت های مکرر برای مدت زمان طولانی نگهداشت اما ترکیب و ساختار آن ممکن است به مرور زمان تغییر کند. چرا که محیط کشت به نفع سلول های معینی عمل نموده و باعث غالب شدن آنها می شود. تحت شرایط رشد مناسب برای رشد سازمان نیافته سلول های مریستمی به طور تصادفی و پراکنده در بافت کالوس قرار دارند. انتقال قطعات کالوس به شرایطی که موجب رشد سازمان یافته می شود به تشکیل مریستموئیدها که مراکز رشد نیز نامیده می شود می انجامد. مریستموئیدها توده های متمرکزی از سلول های شبه کامبیومی هستند که ممکن است به دلیل ظهور سلول های تراکئیدی در مرکز، به آوند نیز مجهز شوند. این توده ها محل تشکیل اندام در بافت کالوس بوده و قادر به تولید ساقه یا ریشه می باشند. اندام زایی هم از سوسپانسیون سلولی و هم از کشت های کالوس امکان پذیر است. فقط لازم است سلول ها را از محیط کشت کالوس به محیط کشت خاص باززایی انتقال داده و سپس به طور مرتب در محیط باززایی تجدید کشت نمود. بنابراین اندام زایی با اثر متقابل کمی تعیین می گردد. بعبارت دیگر مقادیر نسبی مواد و نه مقادیر مطلق آن ها در رشد و نمو سهم دارند (فارسی، م. ج. ذولعلی. ۱۳۸۴).

۲-۴-۷-۲-۱- تشکیل اندام نا به جا به طور مستقیم

بافت های رویشی گیاهان عالی تحت شرایط ویژه قادر به تولید گیاهان نا به جا می باشند. جوانه های نا به جا آنهایی هستند که مستقیماٌ از یک اندام گیاهی یا یک قطعه متعلق به آن و بدون نیاز به کالوس (به عنوان مرحله حدواسط) منشاء می گیرند. تولید ساقه های نا به جا به طور مستقیم بر روی ریشه، برگ، فلس های پیاز یکی از روش های مرسوم تکثیر گیاهان است. در محیط کشت نیز این روش بویژه برای گیاهان علفی مناسب است. تشکیل اندام های نا به جا به فعالیت مجدد ژن های مرتبط با فاز جنین زایی و نمو بستگی دارد (فارسی، م. ج. ذولعلی. ۱۳۸۴).

۲-۴-۷-۲-۲- جنین زایی

در جنین زایی سوماتیکی، جنین ها، سلول ها، بافت ها و یا اندام های سوماتیکی به طور غیر مستقیم (منشاء مجدد) یا مستقیم (منشاء نا به جا) باززایی می شوند که با فرایند جنین زایی زیگوتی جنین کاملاٌ متفاوت است. به طور کلی جنین های سوماتیکی آنهایی هستند که از بافت رویشی در محیط کشت تولید می شوند. جنین زایی سوماتیکی با اندام زایی متفاوت است زیرا جنین یک ساختار دوقطبی با انتهای ریشه ای بسته می باشد، ولی در اندام زایی یک ساختار تک قطبی تولید می شود. جنین از یک سلول منفرد منشاء می گیرد و فاقد ارتباط آوندی با بافت کالوس یا ریزنمونه ها می باشد. علاوه بر این القای جنین زایی سوماتیکی به یک محرک هورمونی خاص برای تشکیل یک ساختار دو قطبی که قادر به تولید گیاه کامل باشد، نیاز دارد در حالیکه در اندام زایی به دو محرک هورمونی مختلف، اول برای تولید ساقه و سپس برای تولید ریشه نیاز است. شارپ (Sharp) و همکاران در سال ۱۹۸۰ دو روش برای جنین زایی سوماتیکی توضیح دادند:

1. جنین زایی مستقیم: در این حالت جنین مستقیماٌ از بافت ریزنمونه و بدون رشد کالوس منشاء می گیرد. این جنین از سلول های اولیه معینی به نام سلول های تعیین شده اولیه برای تولید جنین ایجاد می شود.
2. جنین زایی غیر مستقیم: در این حالت جنین از بافت کالوس که از تکثیر سلول های ریزنمونه تولید می شود منشاء می گیرد. سلول هایی که به تولید جنین می پردازد سلول های تعیین کننده جنین القایی نامیده می شوند. از جمله این سلول ها می توان سلول های آبکش ثانویه در هویج، بافت های برگی قهوه، گل اطلسی، مارچوبه و … را برشمرد.

در اغلب موارد جنین زایی به روش غیرمستقیم می باشد. در این فرایند به مقادیر هورمونی مشخص و ایجاد شرایط ویژه برای شروع رشد کالوس و آماده سازی مجدد این بافت برای ورود به مرحله جنین زایی نیاز می باشد. فرایند جنین زایی رویشی مراحل مختلفی شامل تشکیل کالوس، نو جنین، بلوغ جنین و در نهایت تولید گیاهچه را در بر می گیرد. ترتیب محیط کشت های مورد استفاده و خصوصاٌ هورمونهای رشد نیز اهمیت فراوانی دارد. در بسیاری از گونه ها، یک محیط کشت برای تولید کالوس و نگه داری آن، محیط کشت دیگری برای بالغ شدن جنین سوماتیکی و محیط کشت سومی برای تبدیل این جنین به گیاه، لازم است. انتخاب ماهرانه ترتیب محیط های کشت در مواردی که جنین زایی سوماتیکی رخ نمی دهد و با مشکل انجام می شود ضروری است.

حضور اکسین در محیط کشت برای تشکیل جنین معمولاٌ ضروری می باشد. بافت ها یا کالوس هایی که به طور مداوم در محیط کشت بدون اکسین نگهداری می شوند، معمولاٌ تولید جنین نمی کنند. کالوس در محیط کشت غنی از اکسین تولید و تکثیر می شود. این محیط سبب تولید گروه های متمرکزی از سلول های مریستمی به نام توده های جنین زا (Embryogenic Clamps) می شود. تشکیل جنین های سوماتیکی معمولاٌ بعد از انتقال سلول ها یا کالوس ها به محیط فاقد اکسین یا دارای سطح کمتری از همان اکسین و یا سطح مشابه یا کمتر از یک اکسین ضعیف تر صورت می گیرد. بعد از انتقال به محیطی با اکسین کم یا فاقد اکسین، توده های جنینی به جنین بالغ تبدیل می شوند. در بعضی گیاهان بویژه گراس ها مراحل آغازش و نمو جنین در همان محیط کشت اول انجام می شود و انتقال به محیط غذایی دوم برای رشد جنین ها به گیاهچه لازم است.

جنین های سوماتیکی در محیط های کشت مختلفی از محیط کشت رقیق وایت گرفته تا محیط کشت غنی از نمک MS تولید شده اند، با این حال محیط کشت MS کاربرد وسیع تری داشته است. افزودن ازت احیاء شده به محیط کشت، هم به آغازش و هم به بلوغ جنین کمک می کند. از بین اسیدهای آمینه، فرم طبیعی اسید گلوتامین (L- glutamine) نقش ویژه ای ایفا می نماید. عامل دیگر کلات آهن در محیط کشت است. در غیاب آهن، نمو جنین از مرحله گلبولی شکل (globular) به مرحله قلبی شکل متوقف می شود. افزودن تنظیم کننده های رشد بویژه اکسین و یا اکسین به همراه سیتوکنین برای شروع رشد و القای جنین زایی الزامی است. از میان همه اکسین ها، هورمون ۲,۴-D و بعد از آن NAA بسیار مفید هستند.

از سیتوکنین ها نیز در محیط غذایی اولیه در خلال جنین زایی استفاده می شود. سیتوکنین ها در تسریع بلوغ جنین، بویژه در رشد و نمو کوتیلدون ها مؤثر هستند. در بعضی مواقع سیتوکنین ها برای رشد جنین و تبدیل آن به گیاهچه لازم است.

جیبرلین ها به ندرت در محیط کشت های اولیه استفاده می شوند. اما در بعضی از موارد نقش آنها در تسریع بلوغ جنین، تحریک ریشه دهی و مراحل بعدی رشد گیاه به اثبات رسیده است. نقش هورمون بازدارنده رشد ABA در جنین زایی سوماتیکی زمانی مشخص شده است که در مقادیر غیر بازدارنده مورد استفاده قرار گرفته است. این هورمون نمو و بلوغ جنین سوماتیکی را ترغیب می نماید و همزمان از تکثیر غیرعادی و ظهور جنین های فرعی و نا به جا ممانعت به عمل می آورد. افزودن آن به محیط کشت ممکن است بلوغ سوماتیکی را در شرایطی امکان پذیر سازد که در حالت طبیعی تحت آن شرایط بلوغ سوماتیکی اتفاق نمی افتد.

افزودن زغال فعال به محیط کشت اثرات مفیدی بر رشد و نمو جنین سوماتیکی دارد. محیط کشت های زغال دار مقادیر کمتری از ترکیبات فنیل استیک اسید و فروهیدروکسی بنزوئیک اسید که اثر بازدارنده بر فرایند جنین زایی سوماتیکی دارند نشان می دهند. همچنین ۵-هیدروکسی متیل فورفورال که از تجزیه ساکارز در حین اتوکلاو حاصل می گردد و یک ترکیب بازدارنده است، توسط زغال فعال جذب می شود. شرایط محیطی همچون نور، دما و تراکم سلول های جنین زا در محیط کشت، نیز مهم می باشند. با این حال نوع لوله های کشت، موقعیت جنین در محیط کشت (سطحی یا غوطه ور بودن) و حالت فیزیکی محیط کشت (نیمه جامد یا مایع) اهمیت چندانی ندارد (فارسی، م. ج. ذولعلی. ۱۳۸۴).

۲-۴-۸- کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی

تاکنون مطالعات زیادی در زمینه تولید متابولیت های ثانویه از طریق کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی به امید نیل به تولید تجاری متابولیت های ثانویه از این طریق صورت گرفته است. از مواردی که به تولید تجاری منجر شده است می توان به شیکونین از گیاه سنگ دانه ^[۵۱] اشاره کرد. به منظور القاء یا افزایش تولید درون شیشه ای ترکیبات ثانویه گیاهی تا کنون راهکارهای مختلفی مورد استفاده قرار گرفته است که برخی شامل موارد زیر است:

• 1. بهینه سازی محیط و شرایط محیط کشت
  2. استفاده از سیستم های کشت دو مرحله ای
  3. گزینش سلولی لاین های سلولی پربازده
  4. کشت سلولی تثبیت شده^[۵۲]
  5. استفاده از سیستم های کشت مبتنی بر بافت های تمایز یافته
  6. تغذیه با پیش ماده ها و بیوترانسفورماسیون
  7. رهاسازی محصول به درون محیط کشت
  8. استفاده از محرک ها
  9. نقشه یابی مسیرهای بیوسنتزی و مهندسی متابولیک (۴۹، ۶۵، ۱۰۰، ۱۲۳ و ۱۷۶خلیلی).

بدین ترتیب تاکنون ترکیبات ثانوی بسیاری از کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی جداسازی گردیده است که به موارد زیر می توان اشاره کرد:

۲-۴-۹- تولید متابولیت های ثانویه در محیط درون شیشیه ای

متابولیت های ثانویه موادی هستند که مستقیماً مورد نیاز گیاه نیستند و در واکنش به حشرات، حیوانات علفخوار، تنش ها و … تولید می شوند. در حقیقت متابولیت های ثانویه در چارچوب چرخه های عادی گیاه (فتوسنتز، تنفس، تنفس نوری، سنتز پروتئین ها، چربی ها، تجزیه مواد و …) نمی گنجد. این مواد تنها در تعداد معدودی از گونه های گیاهی یا گاهی اوقات فقط در یک گونه یا یک رقم تشکیل می شوند. متابولیت های ثانویه اغلب ترکیباتی با مولکول حلقوی هستند. این مواد به عنوان دارو، چاشنی غذا، مواد بازدارنده و حشره کش از اهمیت اقتصادی ویژه ای برخوردار هستند.

1. آلکالوئیدها

بیش از ۴۰۰۰ نوع آلکالوئید توسط گیاهان ساخته می شوند که برخی از آنها شامل آتروپین، استریکنین، نیکوتین و کوکائین می باشند.

1. ترپنوئیدها

ترپنوئیدها شامل روغنهای فرار یا اسانس ها هستند.

1. گلیکوزیدها
2. از جمله گلیکوزیدها می توان به استروئیدها، فلاونوئیدها، ساپونینها، مواد فنولی، تاننها، کاردیاک گلیکوزیدها و … اشاره کرد.

متابولیتهای ثانویه زیادی از گیاهان استخراج می شود که در صنعت مورد استفاده قرار می گیرند. در جدول ۲-۱ گروه های مهم متابولیتهای ثانویه تجاری حاصل از گیاهان آمده است.

جدول۲-۱- گروه های اصلی ترکیبات مهم تجاری حاصل از گیاهان

نام گروه ترکیبات نوع و مثالها

دارویی آلکالوئیدها، استروئیدها، آنتراکوئینونها آنزیم پروتئازها (مانند پاپائین) شیرابه ایزوپرنوئیدها (مانند کائوچو) مومها استرهای مومی (مانندهوهوپا) رنگدانه ها رنگها روغنها اسیدهای چرب (مانند دانه های روغنی) مواد شیمیایی کشاورزی حشره کش ها (مانند پیرترین ها) موادبهداشتی روغنهای فرار (مانند مونوترپن ها) افزودنی های غذایی ترکیبات طعم دهنده، شیرین کننده های غیرمغذی (مانند تاماتین ها) صمغ ها پلی ساکاریدها (از جمله صمغ عربی)

۲-۵- تحریک

یکی از راهکارهای بیوتکنولوژیکی به منظور افزایش تولید متابولیت های ثانویه استفاده از محرک ها در کشت سوسپانسیون سلولی و کشت کالوس است ((Valenzuela, A. et.al. 2004.

۲-۵-۱- محرک ها و فرایند تحریک

محرک ها به موادی اطلاق می شود که افزودن آنها در غلظت های کم به یک سیستم سلولی زنده، بیوسنتز ترکیبات خاصی را تحریک یا بهبود می بخشد (Polle, A. Rennenberg, H. 1993).

۲-۵-۲- دسته بندی محرک ها

محرک ها بر اساس منشاء سنتز به عوامل محرک خارجی یا داخلی و یا بر اساس طبیعت به عوامل زنده و غیرزنده تقسیم بندی می شوند(Vanisree, M. Lee, C. 2004).

۲-۵-۲-۱- محرک های خارجی

مواردی هستند که منشاء خارج سلولی دارند مثل پلی ساکاریدها، پلی آمین ها و آمینواسیدها.

۲-۵-۲-۲- عوامل داخلی

موادیبا منشاء داخلی سلولی هستند که از جمله گالاکتورونوئیدها یا هپتا- β گلوکوزید.

۲-۵-۲-۳- محرک های غیر زنده

, Ca²⁺ و یون های کادمیم Cu موادی با منشاء غیر زنده و اغلب شامل نمک های غیر آلی و عوامل فیزیکی از جمله Ph, Cd بالا می باشد.

۲-۵-۲-۴- محرک های زنده

موادی هستند که منشاء بیولوژیکی دارند، از جمله پلی ساکاریدهای مشتق از دیواره سلول گیاهی (پکتینریا، سلولز) و – پروتئین یا پروتئین های درون سلولی که دررابطه Gدیواره میکروارگانیسم ها (لیگنین یا گلوکان) و گلیکوپروتئین ها یا با پذیرنده ها می باشند و به وسیله فعال سازی یا غیر فعال سازی تعدادی از آنزیم ها یا کانال های یونی عمل می کنند (Vanisree, M. Lee, C. 2004).

۲-۵-۳- محرک و انتقال سیگنال

محرکها منابع مختلفی از فاکتورهای زیستی یا شیمیایی هستند که می توانند سبب تغییرات فیزیولوژیکی در موجود زنده شوند. محرک ها برای یک گیاه منابعی از پیام های شیمیایی را می فرستند که سبب رها شدن پاسخ های فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی و تجمع فیتوآلکسین می شود. محرک های غیر زنده مثل یونهای فلزی و ترکیبات و محرک های زنده مثل قارچ، باکتری ها و ویروس ها، به ترکیبات و دیواره سلول گیاهی حمله می کنند. در طی پاسخ به سیگنال محرک سیستم GTP دفاعی گیاه فعال می شود و برخی عوامل از قبیل کانال های یونی مثل کانال یونی کلسیم، پروتئین های متصل به پروتئین)، اسیدی شدن سیتوپلاسم، قلیایی شدن خارج سلولی، انفجار اکسیداتیو و اکسیژن فعال، سالسیلیک اسید و – G)اکسید نیتریک، تولید جاسمونیک اسید، تولید اتیلن و بیان ژن های دفاعی فعال می شوند و نتیجه آن تجمع متابولیت های ثانویه می باشد (شکل ۱-۹) (Blume, B. et.al. 2000). انتقال سیگنال محرک ترکیبی از شبکه هایی با فعالیت های مختلف شامل مسیر های مشترک یا غیر مشترک هستند که انتقال سیگنال را رهبری می کنند. پاسخ هدف به یک محرک ممکن است با پاسخهدف به محرک دیگر متفاوت باشد (Zaho, J. Sakai, k. 2003).

۲-۵-۳-۱- انفجار اکسیداتیو ۱ و اکسیژن فعال ۲ ((ROS

یکی از مسیرهای پاسخ دفاعی سلول گیاهی در برابر پاتوژن یا محرک انفجار اکسیداتیو و اکسیژن فعال است. در برخی موجب تجمع متابولیت های ثانویه شده و در برخی دیگر تأثیری ROS از کشت های سلول گیاهی نشان داده شده است که سبب تجمع متابولیت های ثانویه می شود H _۲ O _۲و O₂^‾ ندارد. در برخی از گیاهان پس از تیمار با محرک، میانجیگری [۱۷۰]، بتا– توجاپلیسین در درخت سرو مکزیکی ^۴ (Zhao, J. 2001)وCatharanthus roseusاز قبیل ایندول آلکالوئیدها^۳در ) و رادیکال H _۲ O _۲ و پراکسید هیدروژن ((O _۲ شامل یون سوپراکسید (‾ROS کاپسیدول^۵ در تنباکو (Parc, S. 2000).

هیدروکسیل است و به وسیله اکسید کردن رنگدانه های فتوسنتزی، چربی های غشایی، پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک باعث خسارت های اکسید کننده می شود (Davies, K. 1987). بنابراین گیاه نیازبه یک سیستم دفاعی ضداکسنده دارد.

شکل ۲-۶- شکل شماتیک از فعال شدن سیستم دفاعی گیاه در اثر تیمار با محرک

۲-۵-۳-۱-۱- سیستم های دفاعی ضداکسنده

است که یکی از اتفاقات مهم در سیستم دفاعی گیاه و ROSنتیجه تیمارها با محرک های زنده و غیر زنده افزایش تولید پاسخ رایج سلول می باشد (Pitta- Alvarez, S. 2000). تمام موجودات هوازی دارای سیستم های دفاع ضداکسندگی آنزیمی و غیرآنزیمی در می باشند. چنین تنوع دفاعی لازم است، زیرا اکسیژن های فعال به طور متنوعی در اجزاء مختلف سلولی ROSمقابل تولید می شوند. همچنین انواع اکسیژن فعال از نظر نفوذپذیری، قابلیت حل شدن و میل ترکیبی با مولکول های بیولوژیکی، با هم تفاوت دارند.از اینرو به یک مجموعه گوناگون از مولکول های دفاعی نیاز است که بتوانند هم در فاز آبی و هم در غشای اجزای مختلف سلول فعالیت داشته باشند، تا به محض تشکیل هر نوع اکسیژن فعال، آنها را غیر فعال سازند. سلول های گیاهی نیز دارای مکانیزم های ضداکسنده هستند که از آنه در مقابل خسارت های اکسید کننده حفاظت می نمایند. حفاظت در برابر فتواکسیداسیون از طریق زدودن انرژی اضافی بوسیله کارتنوئیدها و یا افزایش تجزیه انواع اکسیژن فعال بوسیله افزایش آنزیم های ضداکسنده صورت می گیرد. آنزیم های ضداکسنده مانند سوپراکید دیسموتاز و …. هستند و اولین خط دفاعی سلول(CAT)، کاتالاز (APX، آسکوربات پراکسیداز ((POD)، پراکسیداز (SOD) در برابر حمله گونه های فعال اکسیژن می باشند (Alscher, R. et.al. 1997). گونه های فعال اکسیژن دارای فعالیت دوگانه ای می باشند. بدین صورت که از یک طرف باعث تنش اکسید کننده و تخریب سلول می گردند و از طرف دیگر در نقش محرک جهت افزایش فعالیت آنزیم های ضداکسنده عمل می کنند. مشخص گردیده است که پراکسید هیدروژن تولید شده در پراکسی زوم، به عنوان یک مولکول نشانگر عمل کرده و موجب تغییر در بیان ژن آنزیم هایضداکسنده می گردد (Kuzniak, K. 2002).

۲-۵-۳-۱-۲- پراکسیداز

پراکسیدازها آنزیم های دارای گروه هم هستند که می تواند طیف وسیعی از سوبستراها را به هزینه H₂O₂ اکسید کرده و با بهره گرفتن از ترکیبات فنلی گایاکول^۱ به عنوان دهنده الکترون طبق معادله زیر H₂O₂ را به آب احیاء می کند( Turkan, I. Bor, M, 2005) :

POX

۴guaiacol+4H₂O₂ Tetraguaiacol+8H₂O

۲-۵-۳-۱-۳- آسکوربات پراکسیداز

آسکوربات پراکسیداز از پروتئین های حاوی گروه هم است که از طریق مسیر “اسدا- هالیول” یا چرخه آسکوربیت- گلوتاتیون که با بهره گرفتن از محتوای آسکوربات (Asc) به عنوان دهنده الکترون طبق معادله زیر باعث کاهش پراکسید هیدروژن به آب می گردد:

APX

۲AsA+H₂O₂ ۲MDA³+ 2H₂O₂

APX در بسیاری از گیاهان عالی شناسایی شده است که دارای آیزوزایم های مختلفی می باشد، این آیزوزایم ها در ۴ بخش مجزای سلولی در برگ توزیع شده اند و شامل APX استرومایی ((sAPX، APX متصل به غشای میکروبادی ها از قبیل پراکسی زوم و گلی اکسی زوم ((mAPX، APXمتصل به غشای تیلاکوئیدی در کلروپلاست ((tAPX، APX سیتوزولی ((cAPXو پنجمین آیزوزایم آن شامل (mitAPX)می باشد که به غشاء میتوکندری سلول متصل است [Jimenez, A. et.al. 1997].

در میان آیزوزایم های APX فرم سیتوزولی آن حساسیت بیشتری به تنش های محیطی نشان می دهد. در تنباکو تقریبا ۹۰% از فعالیت APX سلول را cAPX تشکیل می دهد (Yoshimura, K. et.al. 2000).

فصل سوم

بررسی منابع

۳- بررسی منابع

۳-۱- مروری بر مطالعات کشت بافت در گیاهان دارویی

تحقیقات انجام گرفته در مورد گیاه A.annua که بومی منطقه معتدله و دارای ماده ضد مالاریا، ضد تب و کشنده انتخابی سلول های سرطان سینه، آرتمیزنین است کارهای زیادی صورت گرفته است (Prasad, S. 1999).

جدول (۲-۱) نشان دهنده تلاشهای صورت گرفته در کشت بافت Artemisia annua می باشد. در یک آزمایش از گیاهچه های رشد یافته بالغ نوک ساقه جدا و بعد از استریل روی محیط MS حاوی ترکیب فاکتوریل از هورمونهای (۰۱ mgl ^-۱ ۲,۴-D/0 و ۰ و ۱) و (BAPmgl^-1 ۱و ۱/. ، ۰) کشت شد و در تمام این تیمارها کالوس دهی وجود داشت. BAP به تنهایی mgl^-1 ۱/۰ بیشترین مقدار ساقه دهی را دارد. ولی بیشترین ساقه طبیعی در میزان هورمون mgl^-1 ۱ BAP ایجاد شد. میزان آرتمیزنین در ساقه های درون شیشه ای ۳% تا ۵% درصد وزن خشک بود. تمام ساقه ها توسط هورمون IAA ریشه دار شدند ( ۱۹۹۸Bohlmannm, J.). آزمایشات دیگری برای القای ساقه با ترکیبات مختلف هورمونی BAP و NAA صورت گرفت. در ترکیب mgl^-1 NAA 05/0 و mgl^-1 BAP 2 دو نژاد مورد آزمایش ژنوتیپ های ۰۲۵ و ۰۰۱ بالاترین میزان فراوانی ساقه دهی را داشتند بر اساس این نتایج محیط استاندارد محیط MS پایه حاوی mgl^-1 NAA 05/0 و mgl^-1 BAP 2 به عنوان محیط منتخب جهت القای ساقه بعد از تراریختی معرفی شد (۱۹۹۸Bohlmannm, J.).

آزمایشات دیگر نشان داده اند که فراوانی القای ساقه در ژنوتیپ Nj با هورمون هایmgl^-1 NAA 05/0 و BAP 5/0 بالاترین مقدار بود و فراوانی القای ساقه در ژنوتیپ ۰۰۱ با ترکیب NAAmgl^-1 ۰۵/۰ وmgl^-1 BAP 1/0 بالاترین مقدار بود. نکته مهم در القای ساقه این بود که در این روش ساقه ها به طور مستقیم از محل زخم و بدون واسطه کالوس به وجود آمدند ولی در روش های قبلی ابتدا کالوس دهی رخ داده سپس تبدیل به ساقه می گردد. این روش القای ساقه با روش های قبلی متفاوت بود. اولاٌ اینکه در روش های قبلی یک برگ به قسمتهای متعددی تقسیم می شد، در حالی که در این روش تمام برگ به طور کامل درون محیط القایی ساقه قرار می گیرد. برای ژنوتیپ ۰۰۱ سلولها در محل زخم دمبرگ مستعد رشد ساقه اند. در حالی که سلول های سایر بخشهای برگ مستعد تولید کالوس می باشند. ثانیاٌ سن گیاهان ۰۰۱ استفاده شده حدود ۱۵ روز پیرتر از روش قبلی بود. به نظر می رسد برگهای جوان برای القای ساقه در ژنوتیپ ۰۰۱ مناسب نبودند. برای A.annua القای ریشه نسبت به القای ساقه آسان تر است. یک هفته پس از انتقال ساقه ها به محیط القای ریشه، ریشه دهی صورت می گیرد. نتایج نشان داده است که القای ریشه حتی در محیط بدون هورمون و MS پایه رخ می دهد. با این حال محیط های حاوی mgl^-1 NAA 05/0 برای القای ریشه پیشنهاد شده و در غلظت های بالاتر امکان ایجاد کالوس دهی وجود دارد (۱۹۹۸Bohlmannm, J.).

جدول ۳-۱- مطالعات کشت بافت A.annua

منبع	ترکیب هورمونی محیط پایه MS (میلی گرم در لیتر)	نتیجه	ریز گیاه	منبع گیاهی
Nair و همکاران، ۱۹۸۶	۰/۵-۲ NAA/IBA , 0/5 NAA , ۰/۲ BAP	کالوس ساقه،ریشه	ساقه	وحشی
Tawfiqو همکاران، ۱۹۸۹	۲,۴-D , 0/1 KINETIN 1	کالوس	کالوس	-
Kimو همکاران، ۱۹۹۲	۰/۵ pcPA , 5 BAP	کالوس-گال	ریشه	تراریخت با A.rhizogenes
Basile و همکاران، ۱۹۹۳	۰/۱-۰/۲۵ BA , 0/5 2,4-D , 0/5-2 NAA	کالوس	برگ	-
Woerdenbag، ۱۹۹۳	۰/۰۵ NAA- 0/2 BAP	ساقه	برگ و ساقه	ویتنام
Brown، ۱۹۹۴	۱ ۲,۴-D , 0/5 NAA , 2/5 NAA , 0/5- 2/5 BAP	کالوس	هیپوکوتیل	-
Gulati، ۱۹۹۶	۳BAP , 1 NAA, 0/1 GA	ساقه	برگ- ساقه	-
Chen، ۲۰۰۰	۲ BAP , 0/5 NAA	ساقه	برگ	لاینهای ۰۰۱- ۰۲۵
Chensh، ۲۰۰۳	۱ NAA , 0/5 BAP	ریشه مویی	ریشه	تراریخت با A.rhizogenes
Sharafi,Hashemi، ۲۰۰۵-۲۰۰۶	۲ BAP , 0/5 NAA	کالوس- ساقه- ریشه	برگ	ایران

۳-۲- مروری بر مطالعات کاربرد محرک ها در تولید متابولیت های ثانویه

بکارگیری محرک ها، که شامل عصاره مخمر (YE)، سالیسیلیک اسید (SA)، متیل جاسمونات (MJA)، Co²⁺ ,Cd²⁺ ,Pb²⁺ ,Ni²⁺ ,Ag⁺و … می شوند موجب بیوسنتز گروه بزرگی از متابولیت های ثانویه گیاهی در گونه های گیاهی متفاوت می شوند.

سندرا و همکاران (۲۰۰۰) در مطالعه ای که بر روی کشت ریشه های مویین گیاه Brugmansia candida انجام دادند مشخص شد که اضافه کردن نیترات نقره، سالیسیلیک اسید، عصاره مخمر و کلرید کبالت باعث افزایش تولید متابولیت ثانویه اسکوپولامین^[۵۳] می شود [۱۳۷]. نتایج تحقیق یو و همکاران (۲۰۰۱)، تأثیر محرک قارچی (F₅) و SA وSA+F₅ در بیوسنتز تاکسول^[۵۴]در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه Taxus chinensis نشان داد که در تمام تیمارها سرعت رشد سلول ها کاهش یافت به طوری که سرعت رشد در F₅ و SA وSA+F₅به ترتیب برابر با ۸۲، ۹۰و ۸۵ درصد نسبت به کنترل بود. میزان تجمع تاکسول در تیمار با SA+F₅ برابر باmg l^-15/11 که ۵/۱ برابر تیمار F₅، ۳/۲ برابر تیمار SAو ۵/۷ برابر تیمار کنترل بود [۱۶۷]. ژائو و همکاران (۲۰۰۴)، مسیر سیگنالینگ اتیلن و جاسمونیک اسید را در کشت سلولی گیاه Cupressus lustanica تیمار شده با MJA و YE مطالعه کردند [۱۷۲]. نتایج نشان داد محرک ها سبب افزایش بیوسنتز بتا-توجاپلیسین^[۵۵] می شوند و جاسمونیک اسید و اتیلن انتقال سیگنال را برای تولید بتا تو جاپلیسین رهبری می کنند. اثر SA, YE و MJA در تولید راسمیک اسید (RA) در کشت ریشه های مویین گیاه Coleusforskohlii توسط لی و همکاران (۲۰۰۵) بررسی شد و نتایج نشان داد که بالاترین میزان تولید RA در نمونه های تیمار شده با MJA بود [۹۸]. سانچز سامپدرو و همکاران در سال ۲۰۰۵ به بررسی تأثیر متیل جاسمونیک بر تولید سیلی مارین در کشت سلولی خارمریم پرداختند. تیمار کشت های سلولی Silybum marianum با متیل جاسمونیک به میزان زیادی تجمع سیلی مارین را در محیط کشت و سلول ها افزایش داد. افزایش تولید سیلی مارین ۲۴-۱۲ ساعت بعد از تحریک یادداشت شد و در مدت ۷۲-۴۸ ساعت به بالاترین میزان خودش رسید و بعد از آن کاهش یافت [۱۳۴].

نتایج پژوهش های شمس اردکانی و همکاران (۲۰۰۵)، درباره تأثیر محرک ها (, Pb ^۲+ Cd²⁺وAg⁺) بر بیوسنتز پدوفیلوتوکسین در سوسپانسیون سلولی Album Linum مشخص کرد که نقره به طور معنی داری قادر به تحریک تولید پدوفیلوتوکسین در کشت ها شد که این اثر احتمالاٌ مربوط به نقش نقره روی تولید اتیلن بود و معلوم شد که تحریک همچنین بر روی مسیر ثانویه ای که منجر به تولید ماده مؤثره که پدوفیلوتوکسین نیز نمی باشد مؤثر است [۱۴۰]. افزودن نیترات نقره، کلرید کبالت، سولفات والدیم و فنیل آلانین به عنوان محرک های شیمیایی و همچنین استفاده از محرک های استخراج شده از قارچ Rhizopus stoloniferدر کشت سوسپانسیون سلولی درخت سرخدار، میزان تاکسول تولید شده را نسبت به حالتی که هیچ محرکی اضافه نشده بود، چندین برابر افزایش یافت [۱۷].

جی و همکاران (۲۰۰۵) اثر YE و Ag⁺را در تولید تانشیون در ریشه های مویین گیاه Salviamiltiorrhiz بررسی کردند. نتایج نشان داد که در نمونه های تیمار شده با Ag⁺ میزان بیوسنتز تانشیون ۲/۱ برابر نمونه کنترل و در نمونه های تیمار شده با YE 1/3 برابر نمونه کنترل بود و این نتیجه چهار روز پس از اعمال تیمار حاصل شد [۶۴]. یان و همکاران (۲۰۰۶) نشان دادند که در ریشه های مویین گیاه Salvia miltiorrhiza تیمار شده با Ag⁺ میزان بیوسنتز راسمیک اسید و میزان فنل کل افزایش یافت [۱۶۴]. نتایج چو و همکاران (۲۰۰۷) نشان داد که تیمار سوسپانسیون سلولی گیاه Eschscholtzia californica با SA و MJA تولید سانگونارین^[۵۶]۷ روز بعد از تیمار تا mg /g DW 24 افزایش یافت و در روزهای ۹، ۱۲و ۱۶ روند کاهشی داشت [۳۹]. چن و همکاران (۲۰۰۷) تأثیر Ag⁺ در یک دوره ۰، ۴، ۸، ۱۲، ۱۶، ۲۰و ۲۴ در سوسپانسیون سلولی گیاه Cistanche deserticola مطالعه کردند نتایج نشان داد که سرعت رشد سلول های شاهد بیشتر از سلول های تیمار دیده بود. میزان تولید اکینا کوسید^[۵۷] و آکتئوسید^[۵۸] در سلول های تیمار دیده بیشتر از نمونه کنترل بود و ۸ روز بعد از اعمال تیمار شروع به افزایش کرد و این افزایش تا روز شانزدهم ادامه داشت. بالاترین میزان اکیناکوسید و آکتئوسید بعد از تیمار به ترتیب برابر g l^-1 ۷/۱ و ۴/۰ بود [۳۷]. به منظور افزایش بیوسنتز سیرینگین^[۵۹] در سوسپانسیون سلولی گیاه Saussurea medusa از محرک های Ag⁺ و YE و کیپتوزان^[۶۰] استفاده شد و نتایج نشان داد بالاترین میزان تولید سیرینگین ۱۶ روز بعد از اعمال تیمار و برابر mg/l 9/741 بود [۱۷۸].

نتایج پژوهش بونفیل و همکاران (۲۰۰۷) بر روی گیاه Taxus baccataنشان داد که تیمار کشت سلولی این گیاه با MJA موجب افزایش پاکلی تاکسل^[۶۱](mg dm^-3 ۲۵/۴) ۲۴ ساعت پس از اعمال تیمار شد. و بالاترین میزان باکاتین III^[62] ۲۴ ساعت پس از اعمال تیمار و برابر mg dm^-3 ۴/۲ بود [۲۸]. سانچز سامپدرو و همکاران (۲۰۰۸) اثر MJA و YE در سوسپانسیون سلولی گیاه خارمریم بررسی کردند. نتایج نشان داد که میزان تولید سیلی مارین بعد از ۷۲ ساعت به بالاترین مقدار خود رسید [۱۳۵].

۳-۳- مطالعات انجام شده در مورد تأثیر محرک بر فعالیت سیستم آنتی اکسیدانی و فعالیت آنزیم لیپوکسی ژناز

یی و همکاران (۲۰۰۱) میزان POD را در نمونه های تیمار شده کشت سلولی Taxuschinensis با SA و F₅ (محرک قارچی) (و SA+F₅ اندازه گیری کردند و نتایج نشان داد که پس از اعمال تیمار میزان آنزیم شروع به افزایش کرد و بالاترین میزان آن ۳۲ ساعت پس از اعمال تیمار SA+F₅ بود [۱۶۸]. کوماریا و همکاران (۲۰۰۳) ریشه های مویین گیاه Solanum tuberosum را با محرک های مختلف (Fu+Cd, MJA+Fu, MJA, Fu, Cd و MJA+Cd) تیمار کردند. نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم LOX در نمونه های تیمار شده با Fu+Cd نسبت به کنترل ۲۵ برابر شد [۸۹]. ژائو و ساکیا (۲۰۰۳) تأثیر محرک های مختلف (MJA, YE و H₂O₂) را در مسیر سیگنالینگ منجر به تولید بتا- توجاپلیسین را در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه Cupressus iluitanica بررسی کردند ونتایج نشان داد که بالاترین میزان تولید بتا- توجاپلیسین در نمونه های تیمار شده با mg/l YE 1 بود و این در حالی بود که میزان فعالیت آنزیم LOX در نمونه های تیمار شده با H₂O₂ در بالاترین میزان بود و میزان فعالیت LOX در نمونه تیمار شده با YE در رتبه بعدی قرار داشت. در مرحله بعد میزان فعالیت LOX در نمونه های تیمار شده با mg/l YE 1 در زمان های مختلف مطالعه شد و میزان فعالیت آنزیم ۲۴ ساعت پس از اعمال تیمار در بالاترین مقدار بود [۷۰]. کئو و کائو (۲۰۰۴) تأثیر کادمیوم را بر گیاه برنج مطالعه کردند و نتایج حاکی از آن بود که تجمع H₂O₂ نسبت به شاهد افزایش یافت و میزان فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانتی (CAT, POD, APX و SOD) نیز افزایش یافت [۹۴]. علی و همکاران (۲۰۰۵) تأثیر تنش های دمایی را بر روی گیاه کامل Phalaenopsis مطالعه کردند. نتیجه این پژوهش نشان داد که با افزایش دما میزان فعالیت آنزیم LOX افزایش یافت و این افزایش هم در ریشه و هم در برگ مشاهده شد. میزان فعالیت آنزیم POD نیز با افزایش دما افزایش یافت [۱۸]. سانچز سامپدرو و همکاران (۲۰۰۶)، نیز بر روی تجزیه کشت سلولی گیاه خارمریم با بهره گرفتن از آنزیم پراکسیداز به منظور بررسی مسیر های سنتز سیلی مارین کار کردند و نتایج نشان داد که تیمار با MJA تأثیر چندانی در فعالیت آنزیم پراکسیداز ایجاد نمی کند [۱۳۴]. رادراپا و همکاران (۲۰۰۶) ریشه های تراریخت Beta vulgaris را با محرک های زنده (MJA و گلوتاتیمون) و غیر زنده (Ca, Mg و تی دیازورون) تیمار کردند، نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم POD در تیمار با محرک های زنده ۵۵/۳ برابر کنترل بود در حالی که در تیمار با محرک غیر زنده میزان فعالیت آنزیم POD 03/3 برابر نمونه کنترل بود [۱۲۹]. زو و همکاران (۲۰۰۶) میزان فعالیت آنزیم LOX را در سوسپانسیون سلولی گیاه Pueraria thomsonii تیمار شده با محرک های مختلف (قارچ و SA و …) مطالعه کردند. بیشترین میزان فعالیت آنزیم LOX در نمونه های تیمار شده با قارچ دیده شد [۱۶۴]. نتایج مطالعه زو و همکاران (۲۰۰۷) بر تأثیر Ag⁺، YE و کیتوزان در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه Saussurea medusa نشان داد که میزان فعالیت POD در نمونه های تیمار شده با محرک افزایش یافت [۱۶۳]. جینگ و همکاران (۲۰۰۷) تأثیر محرک های SA و Pb⁺ را بر روی گیاه برنج مطالعه کردند. نتایج نشان داد که سرعت رشد در نمونه های تیمار شده با هر دو محرک کاهش یافت و میزان فعالیت H₂O₂ در نمونه های تیمار شده با SA 9/27 درصد نسبت به کنترل افزایش یافت. میزان فعالیت آنزیم های ضد اکسنده (کاتالاز، اسکوربیت پراکسیداز و سوپاکسید دیسموتاز) در نمونه های تیمار شده به مقدار قابل توجهی افزایش یافت [۸۴]. چن و همکاران (۲۰۰۷) سوسپانسیون سلولی گیاه Cistanche deserticolaرا با Ag⁺تیمار کردند بررسی ها نشان داد که میزان H₂O₂، ۶ ساعت پس از اعمال تیمار به ۴۶ درصد رسید در حالی که در نمونه کنترل بالاترین میزان H₂O₂ در ۲۴ ساعت مشاهده شد. بالاترین فعالیت آنزیم های APX، CAT و SOD 6ساعت پس از اعمال تیمار دیده شد. گئو و همکاران (۲۰۰۷) ریشه های Oryza sativa را با SA و کادمیوم تیمار کردند و میزان فعالیت آنزیم POD تا روز دوم پس از اعمال تیمار افزایش یافت، پس از آن روند کاهشی داشت. میزان H₂O₂ در روزهای دوم و سوم بعد از اعمال تیمار ۵/۳ برابر نمونه کنترل شد [۶۹]. نتایج پژوهش هارفوچ و همکاران (۲۰۰۸) نشان داد که تیمار Castanea sativaدر این ویتر با SA بر بیوسنتز اتیلن و پراکسید هیدروژن تأثیر دارد [۷۲]. تیمار گیاه خیار با Mn, SA و SA+Mn نشان داد که میزان فعالیت ROS در تیمار SA کمتر از Mn و بیشتر از SA+Mn بود. و فعالیت POX در تیمار SA+Mn بیشتر از تیمارهای Mn و SA بود [۱۴۳].

فصل چهارم

مواد و روش ها

مواد و روش ها

۴-۱- مواد گیاهی مورد استفاده

ساقه و برگ گیاه درمنه خزری از مزارع شهرستان ساری تهیه شد.

۴-۱-۱- کشت ساقه

به منظور کشت ساقه از بوته هایی به ارتفاع ۵۰ سانتی متر نمونه تهیه گردید و در پتری دیش های حاوی ۲۰ میلی لیتر محیط موراشینگ و اسکوگ^[۶۳](MS) [107] و ۱۲ تیمار هورمونی از هورمون ها بنزیل آمینو پورین^[۶۴]BAP)) و ۲,۴-D کشت داده شد (جدول ۳-۱).

۴-۱-۲- کشت برگ

به منظور کشت برگ از بوته هایی به ارتفاع ۱۵ سانتی متر نمونه های برگی تهیه گردید و در پتری دیش های حاوی ۲۰ میلی لیتر محیط موراشینگ و اسکوگ (MS) [107] و ۱۲ تیمار هورمونی از هورمون های BAP و ۲,۴-D کشت داده شد (جدول ۳-۱). برای کشت برگ ها در محیط کشت پس از ضد عفونی برگ ها، نمونه های برگی به قطعات حدود cm² ۱ برش داده شد و به منظور کالوس دهی بهتر برگ ها، به کمک اسکالپر خراش هایی روی برگ ایجاد شد.

۴-۱-۳- تهیه محیط MS به منظور کشت ریشه های مویین

جهت تهیه محیط کشت MS ابتدا استوک های (محلول های ذخیره) مورد نیاز برای تهیه محیط کشت به شرحی که در بند ۴-۱-۳-۱ آمده آماده شده اند (جدول ۳-۲). سپس در یک ارلن به میزان ۵۰ درصد از حجم نهایی محیط آب مقطر ریخته و میزان لازم از هر یک از استوک ها به آن اضافه شد. همچنین هورمون BAP و ۲,۴-D در این مرحله اضافه شد.میواینوزیتول به صورت پودری و نیز ساکارز (۳۰ گرم بر لیتر) به آن اضافه گردید و پس از آن محیطبه حجم رسانده شد. پس از این مرحله pH محیط به کمک اسید کلریدریک و سود ۱ نرمال تنظیم شد. در مرحله بعد ظرف حاوی محیط کشت در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و فشار ۲/۱ اتمسفر به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو شد. پس از این مرحله توزیع محیط کشت درون پتری دیش ها در زیر دستگاه لامینار صورت گرفت.

۴-۱-۳-۱ طرز تهیه استوک ها

۴-۱-۳-۱-۱- استوک عناصر ماکرو

1. هر یک از عناصر ماکرو محیط MS به اندازه تهیه ۱۰ لیتر محیط کشت وزن گردید.
2. هر یک از مواد وزن شده به صورت جداگانه در مقداری آب مقطر حل شدند.
3. مواد حل شده با هم مخلوط شده و حجم کل آن به ۱ لیتر رسانده شد.

این استوک برای تهیه ۱۰ لیتر محیط کشت کافی می باشد به طوریکه هر ۱۰۰ میلی لیتر از آن برای تهیه ۱ لیتر محیط لازم است [۱۰۷].

۴-۱-۳-۱-۲- استوک عناصر میکرو

1. هر یک از عناصر غذایی میکرو محیط MS به جز آهن (ترکیب آهن با سایر عناصر سبب رسوب دادن استوک خواهد شد) به اندازه ۱۰۰ لیتر محیط وزن شد.
2. هر یک از مواد وزن شده به صورت جداگانه در مقداری آب مقطر حل شد.
3. مواد حل شده با هم مخلوط و حجم کل آن به ۱ لیتر رسانده شد.

این استوک برای تهیه ۱۰۰ لیتر محیط کشت کافی می باشد به طوریکه هر ۱۰ میلی لیتر از آن برای تهیه ۱ لیتر محیط استفاده می شود [۱۰۷].

۴-۱-۳-۱-۳- استوک آهن

استوک آهن معمولا با غلظت ۱۰۰ برابر (برای تهیه ۱۰۰ لیتر محیط) تهیه شد به طوریکه ۱۰ میلی لیتر از آن برای تهیه ۱ لیتر محیط استفاده شد. برای تهیه این استوک دو ماده اتیلن دی آمین تترااستیک اسید (EDTA) به میزان mg 3730 و سولفات آهن به میزان mg 2780 وزن شدند و هر کدام به صورت جداگانه در آب مقطر حل گردید. سپس این دو با هم مخلوط شده و حجم کل به ۱ لیتر رسانده شد. این محلول به نور حساس می باشد به همین خاطر با فویل آلومینیومی پوشانده و در داخل یخچال نگهداری گردید [۱۰۷].

جدول ۳-۲- مواد تشکیل دهنده محیط پایه MS

mg/L	عناصر ماکرو
۱۹۰۰	KNO3
۱۶۵۰	NH4NO3
۳۷۰	MgSO4.7H2O
۴۴۰	CaCl2.2H2O
۱۷۰	KH2PO4
	عناصر میکرو
۲۲٫۳	MnSO4.4H2O
۰٫۸۳	KI
۶٫۲	H3BO3
۸٫۶	ZnSO4.7H2O
۰٫۰۲۵	CuSO4.5H2O
۰٫۲۵	NaMoO4.2H2O
۰٫۰۲۵	CoCl2.6H2O
۲۷٫۸	FeSO4.7H2O
۳۷٫۳	Na2EDTA
	ترکیبات آلی
۰٫۵	Nicotinic acid
۰٫۵	Pyrodoxine- HCl
۰٫۱	Thiamine- HCl
۱۰۰	Myo- Inositol
۲	Glycine
۳۰۰۰۰	Sucrose

۴-۱-۳-۱-۴- تهیه استوک بنزیل آمینو پورین

برای تهیه استوک BAP یک میلی گرم BAP در مقداری NaOH 1 نرمال حل شده و سپس به حجم ۵ میلی لیتر رسانه شد. Lµ ۵۰۰ از این استوک برای تهیه یک لیتر محیط کشت استفاده شد.

۴-۲- محرک های مورد استفاده

متیل جاسمونات (MJA) و سالسیلیک اسید (SA)

غلظت های به کار رفته MJA:

غلظت های تیمار متیل جاسمونات

غلظت محرک M)µ)

۵۰

۱۰۰

غلظت های به کار رفته SA:

غلظت های تیمار سالسیلیک اسید

غلظت محرک mg/50ml cultu

۲

۶

غلظت های در نظر گرفته شده به صورت مجزا اعمال شدند.

به منظور افزودن هر یک از تیمارها به محیط های کشت مورد نظر، ابتدا از هر یک از تیمارها استوکی تهیه شد و بر حسب غلظت مورد نظر از استوک برداشته و به محیط کشت اضافه شد. لازم به ذکر است که تهیه استوک ها به نحوی صورت گرفت که در نهایت پس از افزودن غلظت های مورد نظر به هر یک از محیط های کشت همگی دارای حجم یکسان ( ml51) باشند و در مورد گروه شاهد نیز، به همان میزان، از محیط مورد استفاده در محیط کشت برگ و ساقه (MS حاوی هورمون BAP و ۲,۴-D) اضافه شد.

۴-۲-۱- تهیه استوک محرک ها

۴-۲-۱-۱- استوک متیل جاسمونات

۱۱۴۶/۰ میلی لیتر متیل جاسمونات را در اتانول ۱۰۰ درصد حل کرده و به حجم ۲۵ میلی لیتر رسانده و پس از تنظیم pH(8/5-7/5) فیلتر شد و به منظور هر یک از غلظت های مورد نظر، از استوک برداشته شد و به هر یک از محیط های کشت اضافه شدند. به طوری که برای غلظت MJAMµ ۵۰ به میزانµl 125 از استوک برداشته شد و همین طور برای غلظت MJAMµ ۱۰۰ به میزانµl 250 برداشته می شود.

۴-۲-۱-۲- استوک سالسیلیک اسید

۴۰۰ میلی گرم سالسیلیک اسید وزن شد و به حجم ۴۰ میلی لیتر رسید و پس از تنظیم pH(8/5-7/5) اتوکلاو شد و به منظور هر یک از غلظت های مورد نظر به شرح جدول ۳-۶، از استوک برداشته شد و به هر یک از محیط های کشت اضافه شدند. برای غلظتSA mg/50 ml culture 2 به میزانµl 200 از استوک برداشته شد و همین طور برای غلظت SA mg/50 ml culture 6 به میزانµl 400 از استوک برداشته می شود.

۴-۳- اندازه گیری میزان پروتئین کل از کالوس

محلول های مورد نیاز

بافر استخراج (Tris-HCL): برای تهیه یک لیتر از محلول استخراج، میزان ۴/۱۲۱ گرم تریس در یک لیتر آب مقطر حل کرده و اسیدیته (Ph) محلول توسط اسید کلریدریک به ۸/۶ رسانده می شود ، بدین صورت محلول بافر مورد نظر آماده میگردد.

معرف برادفورد (Bradford) : برای تهیه معرف بردفورد ، مقدار ۱۰۰ میلی گرم کوماسی برلیانت بلو G250 در ۵۰ میلی لیتر اتانول ۹۵ درصد حل شد .حداقل یکساعت عمل همزدن به منظور حل شدن کامل انجام گردید . سپس ۱۰۰ میلی لیتر اسید فسفریک ۸۵ درصد قطره قطره به محلول اضافه شود و حجم محلول کل با کمک آب مقطر به یک لیتر رسانده شد سپس محلول از کاغذ صافی واتمن (نمره یک) عبور داده شد . این معرف تا دو هفته پایدار بوده و در دمای آزمایشگاه قابل نگهداری است .اما بهتر است به مدت یک هفته مورد استفاده قرار گیرد.

روش کار

کلیه مراحل استخراج پروتیین از بافت گیاهی در دمای ۴ درجه سانتیگراد و در یخ انجام شد تا دمای بالای محیط باعث تغییر ماهیت پروتیین های نمونه و شکستن آنها نشود.

• ابتدا ۱/۰ گرم از ریشه های فریز درایر شده توزین و در هاون چینی ساییده شد.
• ۷ میلی لیتر بافر استخراج به نمونه ها اضافه گردید و به مدت ۳۰ ثانیه ساییده شد.
• مواد را به یک فالکون ۱۵ میلی لیتری انتقال داده شد و به منظور استخراح بهتر پروتیین فالکون های حاوی نمونه به مدت ۲۴ ساعت در حالت سکون در سردخانه در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شد.
• فالکون ها در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۴ دقیقه با دور ۱۶۰۰۰ سانتریفیوژ شد.
• ۱/۰ میلی لیتر از فاز رویی برداشته شد و ۵ میلی لیتر به آن معرف بردفورد اضافه گردید و سریعا ورتکس شد و به مدت ۲۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
• میزان جذب نوری محلول با دستگاه اسپکتروفتو متری در طول موج ۵۹۵ نانومتر خوانده شد.

تهیه استانداردهای پروتیین

برای تهیه استانداردهای پروتیین از البومین سرم گاوی استفاده شد.بدین منظور ۱۰۰ میلی گرم ماده آلبومین گاوی در یک میلی لیتر بافر استخراج حل نموده و با آب مقطر به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد .در این صورت محلول استوک استاندارد ppm100 بود. مقادیر ۲/۰ ، ۴/۰ ، ۶/۰، ۸/۰ و ۱ میلی لیتر برداشته شد و با آب مقطر به حجم ۱۰ میلی لیتر رسانده شد.مقدار ۵ میلی لیتر معرف برادفورد به آن افزوده و سریعا ورتکس شد . پس از ۲۵ دقیقه نگهداری در دمای ۴ درجه سانتیگراد ، میزان جذب نوری محلول حاصل با دستگاه اسپکتروفتو متری در طول موج ۵۹۵ نانومتر خوانده شد و منحنی استاندارد جهت اندازه گیری غلظت پروتیین محلول نمونه ها رسم شد .برای تهیه نمونه شاهد یا صفر کافیست که به جای عصاره پروتیینی ،۱/۰ میلی لیتر آب مقطر درون فالکون ریخته شود و به آن معرف برادفورد اضافه گردد.

۴-۴-آسکوربات پراکسیداز

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (۱۰۱۱۰۱۰۱۱ APX,EC) به روش ناکانو و اسدا (۱۹۸۷) اندازه گیری شد.مخلوط و اکنش حاوی مواد شیمیایی زیر بود :

آسکوربات ۵/۰ میلی مولار محلول در بافر فسفات پتاسیم ۱۰۰ میلی مولار ۸۵۰ میکرو لیتر

پراکسید هیدروژن ۲ میلی مولار محلول در آب دوبار تقطیر ۱۵۰ میکرو لیتر

از مخلوط واکنش بدون عصاره آنزیمی در یک کیووت کوارتز ۱ میلی لیتری به عنوان شاهد اسپکتروفتومتر در طول موج ۲۹۰ نانومتر استفاده شد. سپس ۳۰ میکرو لیتر از عصاره آنزیمی به آن اضافه شده و منحنی فعالیت آنزیم کاتالاز در مدت زمان ۱۸۰ ثانیه و بر حسب Abs/min ترسیم شد.

نحوه عمل

آنزیم اسکوربات پراکسیداز ، طبق معادله زیر پراکسید هیدروژن را با بهره گرفتن از اسکوربات به اب احیا میکند:

معادله ۴-۱

APX2AsA + H2O2 2 MDA + 2 H2O

از انجاییکه حداکثر جذب اسکوربات در طول موج ۲۹۰ نانومتر صورت میگیرد ،لذا زمانیکه آنزیم اسکوربات پرکسیداز در محیط بوده و فعالیت میکند به تدریج اسکوربات تجزیه شده و به طبع آن از میزان آسکوربات محیط کاسته شده و میزان جذب در طول موج ۲۹۰ نانومتر به تذریج کاهش می یابد. شکل ۳-۹ نحوه فعالیت آنزیم اسکوربات پراکسیداز را در یکی از نمونه های آزمایشی نشان می دهد.

۴-۴-۱- محاسبه فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز بر اساس میزان تجزیه شدن H2O2 در طول موج ۲۹۰ نانومتر و با بهره گرفتن از ضریب خاموشی ۲/۸ Mm-1 cm-1 تعیین گردید . جهت تعیین فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز نیز از رابطه ۱-۲ استفاده شد. با این تفاوت که A240 به A290 و ضریب ۲ به ۱ ( با توجه به ضریب H2O2 در معادله ۴-۱) تبدیل شد.فعالیت ویژه آنزیم آسکوربات پراکسیدازبه صورت تعداد میکرو مول H2O2 تجزیه شده در دقیقه در میلی گرم پروتئین گزارش گردید.

Activity (U/ml)= A₂₄₀ × L ×V_t × d_f / Ɛ × l × t× V_s

U واحد آنزیمی

A₂₄₀ تفاوت میزان جذب مخلوط واکنش در زمان شروع

L با توجه به ضریب پراکسید هیدروژن در معادله (۱-۲) تعیین می گردد که معادل ۴ می باشد

V_t حجم مخلوط واکنش (در این آزمایش برابر یک میلی لیتر بود).

d_f فاکتور رقیق کننده

t مدت زمان واکنش (۱ دقیقه)

V_s حجم نمونه

Ɛ ضریب خاموشی برابر ۲۶/۶ Mm^-1 cm^-1

l طول مسیر عبور نور از مخلوط واکنش (برابر یک است).

۴-۵- استخراج آرتمیزنین

به منظور استخراج آرتمیزنین از کالوس، ۲g کالوس به کمک ازت مایع پودر شد سپس در هر تیوپ حاوی نمونه پودر شده، ۵ml تولوئن اضافه شد و تحت سانتریفیوژ به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۱۰۰۰ rpm قرار گرفت. سپس سانیکیشن به مدت ۱۰ دقیقه روی نمونه ها انجام شد و دوباره سانتریفیوژ با دور ۴۵۰۰ rpm به مدت ۱۰ دقیقه در دمایC ˚۴ انجام شد و مایع بالایی برداشته شد و داخل لوله های آزمایش ریخته شد تا در هوای آزاد با دمای C ˚۲۰ خشک شود. نمونه ها پس از این مرحله در دمای C ˚۲۰- تا زمان انجام اسپکتروفتومتری نگه داری شد (Kim et al. 2001).

۴-۵-۱- آماده سازی

مواد خشک استخراج شده با ۴۰۰µM متانول و ۴۰۰ µl از محلول (w/v) 2% NaOH ترکیب شده و به مدت ۴۵ دقیقه در دمای C ˚۴۵ قرار دادیم. سپس تیوپ ها را روی ظرف یخ گذاشته و ۴۰۰ µl از محلول آماده سازی شده ۰/۲ M استیک اسید برای متوقف سازی واکنش به نمونه ها اضافه می شود. با اضافه کردن ۱۰۰ µl متانول حجم هر تیوپ را به ۱ml می رسانیم. نمونه ها پس از این مرحله در فریزر درایر قرار داده می شود و سپس نمونه خشک شده با ۵ ml اتانول به همراه ۰/۳ ml TFA (10% v/v) حل می شود و برای اندازه گیری آرتمیزنین، محلول بدست آمده را در سل دستگاه تزریق می کنیم. همین مراحل برای آماده سازی استاندارد نیز انجام شد (Smith et al., 1997).

۴-۶- طرح و آنالیز های آماری

داده های حاصل با بهره گرفتن از نرم افزارهای کامپوتریGenstat تجزیه و تحلیل شدند. و میانگین ها با بهره گرفتن از آزمون LSD در سطح احتمال ۵ درصد مقایسه شدند. در ضمن تیمارهای به کار رفته با بهره گرفتن از آزمایش فاکتوریل بر مبنای طرح کاملا تصادفی در ۳ تکرار مورد بررسی و تجزی و تحلیل قرار گرفتند.

فصل پنجم

نتایج

۵-۱- نتایج حاصل از کشت بافت A.annua

بذور در روز دوم جوانه زدند و گیاهچه ها پس از رشد یکماهه دارای برگهای قابل توجهی شدندکه برای استفاده به عنوان ریزگیاه مناسب بودند،لذا از آنها به عنوان ریزگیاه استفاده شد.پس از قرار گیری ریز نمونه ها در محیط های ذکر شده نتایج مختلفی برحسب محیطهای کشت به دست آمد که در جدول ۵-۱آورده شده است.

اگر ریز نمونه های منتقل شده به محیط های هورمون دار هر دو هفته یکبار در محیط تازه واکشت نشود امکان قهوه ای شدن و از بین رفتن ریز نمونه ها وجود خواهد داشت. پس از ۳ بار واکشت درمحیط های هورمون دار اغلب ریز نمونه ها به مرحله کالوس زایی رفته و با انتقال به محیط MS همراه با هورمون باززایی، در برخی از تیمارها جنین سوماتیکی تشکیل شده و باززایی نو ساقه صورت گرفت.

در تمام تیمارهای هورمونی با ۲,۴ –D(mgl ^-۱۵/۱،۱، ۵/۰)وBAP (mgl ^-۱۲، ۱، ۵/۰) در ریز نمونه ی برگ و ساقه پس از ۳ هفته کالوس دهی رخ داد (جدول ۵-۱)(شکل ۵-۱ و ۵-۲). با توجه به جدول تجزیه واریانس (جدول ۵-۲) تیمارهای مختلف هورمونی (BAP, 2,4-D) روی درصد کالوس دهی در هر دو ریز نمونه ی برگ و ساقه تفاوت معنی داری را نشان نداده است. اثر هورمونی بر وزن تر کالوس ها در تیمار با ۲,۴-D تفاوت معنی داری را در سطح ۵ درصد در ریزنمونه های برگی نشان می دهد (جدول ۵-۲). به طوری که در غلظت۲,۴-D mg/l 5/1 بیشترین وزن تر کالوس بدست آمد و افزایش غلظت ۲,۴-D وزن تر کالوس را افزایش داد (نمودار۵-۱). با توجه به آنالیز داده ها غلظت های مختلف BAP باعث شد اختلاف معنی داری با احتمال ۹۹ درصد در وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه برگی مشاهده شود (جدول ۵-۲). در کالوس حاصل از تیمار BAPmg/l2 بیشترین وزن تر کالوس حاصل شد و افزایش غلظت BAP باعث افزایش وزن تر کالوس شد (نمودار ۵-۲). اثر متقابل هورمون های۲,۴-D و BAP روی وزن تر کالوس برگی در سطح ۱ درصد معنی دار شد و بیشترین مقدار آن در غلظت۱٫۵ mg/l 2,4– Dو ۱ mg/l BAP بدست آمد (نمودار ۵-۳). با توجه به نمودار ۵-۳ در سطح مساوی از ۲,۴-D، افزایش غلظت BAP روی وزن تر کالوس ها اثر معنی داری را نشان می دهد

با توجه به جدول تجزیه واریانس غلظت های مختلف هورمونی در وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه برگ و ساقه اختلاف معنی داری را نشان نداده است (جدول ۵-۲).

جدول۵-۱ اثر تیمارهای هورمونی بر درصد کالوس دهی

۲, ۴-D (mg/l)	BAP)mg/l)	%کالوس حاصل از برگ	% کالوس حاصل از ساقه
۰٫۵	۰٫۵	۱۰۰	۱۰۰
۰٫۵	۱	۹۳٫۳۳	۸۶٫۶۶
۰٫۵	۲	۹۳٫۳۳	۸۶٫۶۶
۱	۰٫۵	۹۳٫۳۳	۱۰۰
۱	۱	۹۳٫۳۳	۹۳٫۳۳
۱	۲	۹۳٫۳۳	۸۶٫۶۶
۱٫۵	۰٫۵	۹۳٫۳۳	۸۶٫۶۶
۱٫۵	۱	۹۳٫۳۳	۹۳٫۳۳
۱٫۵	۲	۸۶٫۶۶۰	۱۰۰

 

جدول ۵-۲) نتایج بدست آمده از محیط های مختلف در القای کالوس
منابع تغییر	درجه آزادی	واریانس
		کالوس­دهی برگ	کالوس­دهی ساقه	وزن تر کالوس برگ	وزن تر کالوس ساقه
غلظت ۲, ۴-D	۲	ns037/0	ns037/0	*۰۳۳/۰	ns008/0
غلظت BAP	۲	ns259/0	ns148/0	**۰۹۸/۰	ns003/0
۲, ۴-D × BAP	۴	ns148/0	ns481/0	**۰۴۰/۰	ns007/0
خطای آزمایشی	۱۸	۲۲۲/۰	۳۳۳/۰	۰۰۸/۰	۰۰۷/۰
CV%		۹/۹	۵/۱۲	۰/۱۰	۶/۱۰

 

شکل ۵-۱)اثر هورمون ۲, ۴-Dبر وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه­ برگی	شکل ۵-۲)اثر هورمون BAP بر وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه­ی برگی
­
شکل ۵-۳)اثر متقابل هورمون ۲, ۴-Dو BAP بر وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه­ی برگی

 

شکل۵-۴)کالوس حاصل از ریزنمونه برگ شکل۵-۵)کالوس حاصل از ریزنمونه ساقه