شناساگرهای بیکون مولکولی[۸۸]
یکی دیگر از روشهای آشکارسازی استفاده از شناساگرهای بیکون مولکولی (MB) است. این گونه شناساگرها بر اساس یک ساختار سنجاقسری[۸۹] طراحی میشوند که دارای یک رنگ گزارشگر فلورسنتی در یک انتها و یک مولکول خاموشگر در انتهای دیگر هستند. ساختار سنجاقسر باعث میشود شناساگرهای MB در هنگام هیبرید نشدن به صورت تاخورده[۹۰] درآید. این حالت باعث میشود تا مولکولهای خاموشگر و گزارشگر در نزدیکی یکدیگر قرار گیرند و سیگنال فلورسانسی تشکیل نشود (و یا در صورت تشکیل بسیار کم باشد). با این وجود هنگامی که شناساگرMB با الگوی خود هیبرید میشود،ساختار سنجاقسر باز شده و رنگ گزارشگر از مولکول خاموشگر فاصله میگیرد. در این لحظه دستگاه Real-Time PCR سیگنال فلورسنتی ایجاد شده را شناسایی میکند. در این سیستم امکان آنالیز منحی ذوب نیز وجود دارد[۲۶،۱۴،۴].
شکل( ۱-۱۶) : مکانیسم عمل شناساگرهای بیکون مولکولی طی واکنش زنجیرهای پلیمراز(PCR).
اینشناساگر قبلازاتصالبه DNA بهصورتلوپاست. بهعلتنزدیکی دو مولکول گزارشگر و خاموشگر،نورساطعشدهتوسط خاموشگرمهارمیشود. پساتصالشناساگربهمحلموردنظرخود،ساختار سنجاقسر بازشده،درنتیجهرنگهاازهمدورمیشوندوتابشنورازگزارشگرانجاممیگیرد.
سیستم شناساگر FRET[91]
شناساگرهای FRET بر اساس انتقال انرژی از یک رنگ فلورسنتی به رنگ دیگر عمل میکنند. دو توالی الیگونوکلئوتیدی اختصاصی مجزا،با رنگهای فلورسنت نشاندار میشوند. شناساگری که در بالادست[۹۲] قرار میگیرد،در انتهای ۳’ خود یک مولکول دهنده[۹۳] دارد و شناساگری که در پاییندست قرار میگیرد دارای یک مولکول پذیرنده[۹۴] در انتهای ۵’ خود است. پروبها به گونهای طراحی میشوند که در فاصله کمی با یکدیگر روی توالی هدف هیبرید شوند. زمانی که شناساگرها هیبرید شدند، مولکولهای فلورسنتِ دهنده و پذیرنده در نزدیکی هم قرار میگیرند. این امر باعث میشود که انرژی از فلوروفور دهنده به پذیرنده انتقال یابدو سیگنالی با طول موج متفاوت گسیل شود. سپس کاهش میزان رنگ فلورسانس مولکول دهنده و یا افزایش رنگ فلورسانس پذیرنده توسط دستگاه شناسایی میشود. از این رو تنها زمانی که شناساگرها به هم متصل شوند،سیگنال فلورسنتی قابل شناسایی است. در این سیستمآنالیز منحنی ذوب تشکیل میشود. از این سیستم در تشخیص ژنوتیپ،شناسایی پلیمورفیسم تکنوکلئوتیدیو تشخیص دیگر جهشها استفاده میشود[۲۶،۱۴،۴].
شکل( ۱-۱۷) : مکانیسم عملشناساگر FRET طی واکنش زنجیرهای پلیمراز(PCR).
انتقال انرژی رزونانس در هنگام آزاد بودن شناساگرها بسیار کم است امّا هیبریداسیون شناساگرها منجر به نزدیک شدن فلوروفورهای مولکول دهنده و پذیرنده،و در نهایت افزایش سیگنال میشود.
شناساگرهای عقربی[۹۵]
برخلاف شناساگرهای دوسویه نشاندار و شناساگرهای MB، مکانیسم شناساگرهای عقربی درون مولکولی[۹۶] است. ساختار این شناساگرها شامل یک حلقه سنجاقسر متصل به انتهای ۵’ پرایمر و یک مهارکننده PCR[97] است. بعد از مرحله طویل شدنِ آغازگر،طی واکنش تکثیری،شناساگر اختصاصی قادر خواهد بود به ناحیه مکمل خود (درون رشته مولکول DNA) اتصال یابد. پدیده هیبرید شدن شناساگر با الگو،منجر به باز شدن حلقه سنجاقسرمی شود. در نتیجه مولکول فلورسانس از مولکول خاموشگر فاصله گرفته و سیگنال افزایش مییابد. شناساگرهای تکمولکولی[۹۸] از نظر کینتیک (سرعت) مطلوب و کارآ هستند. اتصال دوتایی[۹۹] (دوگانه) شناساگر به قطعه تکثیریِ[۱۰۰]هدف،تضمین میکند که هر شناساگر دارای یک هدف در آن ناحیه باشد. در این روشبرشآنزیمی وجود ندارد، از این رو زمان لازم برای سیگنالدهی کاهش مییابد. در عوض شناساگرهای دوسویه نشاندار بایستی ابتدا به توالی هدف متصل و سپس شکسته شوند تا افزایش سیگنال مشاهده شود. از شناساگرهای عقربی به طور گستردهای در شناسایی و تشخیص جهش استفاده میشود. این شناساگرها علاوه بر اختصاصیت و آنالیز منحنی ذوب شناساگرهای بیکون مولکولی (MB)، سرعت بالایی دارند و بسیار کارآمد هستند[۲۶،۱۴،۴].
شکل( ۱-۱۸) : مکانیسم عمل شناساگر عقربی طی واکنش زنجیرهای پلیمراز(PCR).
بعد از مرحله طویل شدنِ آغازگر،طی واکنش تکثیری،شناساگر اختصاصی قادر خواهد بود به ناحیه مکمل خود (درون رشته مولکول DNA) اتصال یابد. پدیده هیبرید شدن شناساگر با الگو،منجر به باز شدن حلقه سنجاقسرمی شود. در نتیجه مولکول فلورسانس از مولکول خاموشگر فاصله گرفته وسیگنال افزایش مییابد.
۱-۵-۴-۲-۵- علاوه بر موارد مذکور،سیستمهای دیگری نیز برای روش دومِ انجام واکنشReal-Time PCR وجود دارد که از توضیح آنها در مطالعه حاضر صرف نظر شدهاست. این سیستمها شامل سیستمتشخیص ژنوتیپ-SNP آمپلیفلور، سیستم مستقیم ژنی آمپلیفلور[۱۰۱]، شناساگر های سایهافکن[۱۰۲]و شناساگر های نورانی[۱۰۳] (درخشان) میباشد[۱۴].
۱-۵-۵- برخی مفاهیم و اصطلاحات در واکنش Real-Time PCR
۱-۵-۵-۱- منحنی تکثیر[۱۰۴]
این نمودار،نموداری است که در آن،تعداد چرخهها[۱۰۵] در مقابل شدّت نور فلورسنت رسم می شود. این منحنی شامل ۴ فاز است : ۱- فاز خط پایه[۱۰۶]،۲- فاز نمایی[۱۰۷]،۳- فاز خطی[۱۰۸]،۴- فاز پلاتو[۱۰۹].
فاز خط پایه،فازی است که در آن،واکنشتکثیر آغاز می شود و تا چند چرخه ابتدایی(معمولاً ۱۵-۳ چرخه)،ادامه مییابد امّا سطح فلورسنت تولیدی در این مرحله برای دستگاه قابل شناسایی نیست. در واقع چرخههای ابتدایی که در آنها شدّت فلورسنت تغییر معناداری نکردهاست و سیگنال قابل قبولی به دستگاه نفرستادهاست. گرچه در این فاز سیگنال تشخیصی دستگاه وجود ندارد امّا تکثیر تصاعدی DNA در حال رخدادن است.
فاز نمایی،فازی است که در آن،تکثیرِ تصاعدی در بالاترین میزان خود،انجام می شود و اوّلین سیگنال قابل تشخیص برای دستگاه فرستاده می شود. طول مدّت این فاز به غلظت نمونه و کیفیت واکنش Real-Time PCR بستگی دارد.
فاز خطی،فازی است که در آن،به علت مصرف واکنشدهندهها مثل پرایمر،dNTP و …،راندمان تکثیر کاهش مییابد و وارد فاز پلاتو می شود.
فاز پلاتو،فازی است که در آن، تولیداتPCRرو به تنزل میباشند و واکنش به طور ناگهانی برای چرخههای بعدی،متوقف می شود[۲۶،۱۴،۴].
شکل (۱-۱۹) : منحنی تکثیر در واکنش Real-Time PCR
در این منحنی، تعداد چرخهها در قبال شدت نور فلورسنت رسم می شود. این منحنی شامل ۴ فاز است : اولین فاز،فاز خط پایهاست که واکنشتکثیر آغاز می شود و تا چند چرخه ابتدایی، ادامه مییابد امّا سطح فلورسنت تولیدی در این مرحله برای دستگاه قابل تشخیص نیست. فاز دوم، فاز نمایی است که در آن تکثیرِ تصاعدی در بالاترین میزان خود، انجام می شود و اوّلین سیگنال قابل شناسایی برای دستگاه تولید می شود. فاز سوم، فاز خطی است که راندمان تکثیر در آن کاهش مییابد و علّت این امر مصرف واکنشدهندهها مثل پرایمر،dNTP و … است. فاز چهارم، فاز پلاتو است که در این فاز، تولیداتPCR رو به کاهش میگذاردوواکنش به طور ناگهانی برای چرخههای بعدی، متوقف می شود.
۱-۵-۵-۲- گزارشگر نرمالشده(Rn)[110]
بین چاهکهای دستگاه Real-Time PCR یکسری نواسانات وجود دارد که ناشی از خطای کاربر در تغییرات غلظت و حجم واکنش یا خطای پردازش دستگاه است. برای تصحیح این نوسانات،نور فلورسنت نرمالایز می شود.برای این کار از فاکتوری به نام Rn استفاده می شود.
شدّت فلورسنت انتشار یافته توسّط یک رنگ گزارشگر
Rn=
شدّت فلورسنت انتشار یافته توسّط یک رنگ مرجع خنثی[۱۱۱]
رایجترین رنگ مورد استفاده بهعنوان رنگ مرجع خنثی،رنگ ROX میباشد. مواد تشکیلدهنده این رنگ شامل :۵-carboxy-X-rhodamine ,0.1mM EDTA, 10mM Tris-HCl (pH 8.6)، میباشد.[۲۶،۱۴،۴]
شکل (۱-۲۰) : رنگ مرجع خنثی)(ROX
۱-۵-۵-۳- چرخه آستانه (CT)[112]
به اوّلین چرخهای که شدّت نور فلورسنت آن به طور معناداری از خط پایه بیشتر است و اوّلین سیگنال قابل تشخیص برای دستگاه است،چرخه آستانه گفتهمی شود. عدد CT با مقدار الگوی اولیه،رابطه معنیداری دارد و از روی آن میتوان مقدار نمونه اولیه را تخمین زد.هر چه مقدار الگوی اولیهبیشتر باشد،مقدار CT کم می شود. چرا که تعداد مولکول فلورسنت بیشتری در نتیجه سنتز محصول بیشتر،به جهت وجود DNAالگوی بیشتر،در هر چرخه سیگنال تولید می کند و واکنش سریعتر و در چرخهای با شماره کمتر به فاز نمایی وارد میشود[۲۶،۱۴،۴].
شکل (۱-۲۱) : منحنی تکثیر و نمایش CT
عدد CT با مقدار الگوی اولیه،رابطه معنیداری دارد. هر چه مقدار الگوی اولیه بیشتر باشد،مقدار CT کم می شود. در واقع سطح آستانه که بالاتر از میزان فلورسنت پایه است، موجب مشخص شدن CT در هر منحنی میگردد. با مقایسه CT دو نمونه میتوان میزان الگوی اولیه آنها را مقایسه نمود.
۱-۵-۵-۴- منحنی ذوب[۱۱۳]
در PCRمعمولی،تعیین اختصاصیت سیگنالها(فصل اوّل-فورمت غیر اختصاصی-رنگهای اینترکاله)،از طریق استفاده از ژل آگارز و ارزیابی وزن مولکولی باند مورد نظر است. در Real-Time PCR،اطمینان از اختصاصی بودن محصول با تعیین درجه دمای ذوب[۱۱۴]™،صورت میگیرد.دمای ذوب دمایی است که در آن ۵۰% از مولکول DNA به صورت واسرشتشده باشد. در واکنش Real-time PCR،پس از اینکه واکنش وارد فاز پلاتو شد،با تنظیمات قبلی،واکنش وارد فاز نمودار ذوب می شود تا منحنی ذوب ترسیم و آنالیز گردد. مراحل به این صورت که ابتدا حرارت از دمایی پایینتر از نقطه ذوب محصولات شروع می شود و تا دمایی بالاتر از نقطه ذوب افزایش مییابد تا رشته های DNA،از هم باز میشوند.اگر مخلوط DNAدو رشتهای در حضور SYBR-Green به دمای ذوب خود نزدیک شود،کاهش شدیدی در میزان فلورسنت توسط دستگاه ثبت می شود. لذا در پایان آزمایش با ذوب محصولات تکثیر شده در حضور رنگهای اینترکاله،یک یا چند منحنی تشکیل می شود. محصولات تکثیرشده در دماهای متفاوتی بر اساس طول قطعه تکثیری و میزان G-C،به نقطه ذوب میرسند. هنگامی که محصولات،واسرشت شوند،میزان فلورسنت کاهش یافته و توسط دستگاه اندازه گیری می شود. سپس قلّههای ذوب[۱۱۵] را میتوان بررسی کرد. این قلّهها معادل باندهای مشاهدهشده در ژل الکتروفورز شده در PCRمعمولی میباشند. وجود یک قلّه نشانگر اختصاصیت واکنش است امّا بیش از یک قلّه وجود توالیهای غیراختصاصی را نشان میدهد[۲۶،۱۴،۴].
شکل (۱-۲۲) : منحنی ذوب و Tm
وجود یک قلّه نشانگر اختصاصیت واکنش است امّا بیش از یک قلّه وجود توالیهای غیراختصاصی را نشان میدهد.
۱-۵-۵-۵- منحنی استاندارد[۱۱۶]
برای تعیین کیفیت یک آزمایش،رسم منحنی استاندارد لازم و ضروری است. یک منحنی استاندارد برای یک جفت آغازگرِ خاص بوسیله تهیه یک رقّت سریالی از نمونه الگو،بدست می آید.برای بدست آوردن رقّت سریالی کافی است غلظت نمونه الگو را با دستگاه نانودراپ اندازه بگیریم و سپس نمونه را با فاکتور رقّت خاص مثل ۵،۱۰،… رقیق کنیم. برای رسم نمودار استاندارد حداقل ۵ نقطه لازم است. بنابراین به گونه ای رقیقسازی میکنیم که در ۵ غلظت متفاوت DNA داشتهباشیم که همه غلظتها برای دستگاه قابل خوانش باشند. غلظتهای بالا محدودکننده واکنش و غلظتهای پایین غیر قابل تشخیص برای دستگاه هستند.در اکثر نرمافزارهافمنحنی استاندارد به صورت نموداری روی محور XY ترسیم می شود. در این نمودار لگاریتم رقّت/تعداد نسخه روی محور X و میانگین میزان CT روی محورY قرار دارد.علاوه بر رسم منحنی،بخش نرمافزاری دستگاه ضرایب r،R2،شیب منحنی و بازده تکثیر را محاسبه نموده که هر یک از این فاکتورها برای ارزیابی کیفیت آزمایش مورد استفاده قرار میگیرد. تفاوت معنیدار در بازدهی تکثیر یا ارزش CT در تکرارهای مربوط به یک نمونه،باعث کاهش ارزش r و R2 می شود. در حالت نرمال و مطلوب آزمایش،۹۹۰۱/۱۰ <r و ۹۸۰/۰ <R2 خواهد بود.
بازدهی تکثیر توسط شیب منحنی استاندارد و از طریق فرمول زیر محاسبه می شود :
E = 10-1/slope