1-2- راديکال‌هاي آزاد
1-2-1- تعريف و نحوه تشکيل راديکال‌‌های آزاد
راديكال‌هاي آزاد^[6]، تركيبات شيميايي حدواسط با طول عمر كوتاه بوده که دارای یک الکترون جفت نشده می­باشند، تمام والانس‌های آن­ها اشباع نشده و در واقع مولکولی غیر­اشباع هستند که برای به دست آوردن الکترون به مولکول­های پایدار در اطراف خود حمله کرده و الکترون خود را به دست می­آورند و بدین ترتیب سبب اکسایش مولکول­های دیگر می­شوند و این چرخه ادامه می­یابد(Gutteridge & Halliwell, 1999).

1-2-2- نحوه عملکرد راديکال‌هاي آزاد
راديکال­هاي آزاد از چندین طریق نقش خود را ایفا می­ کنند:

• • يک راديکال آزاد می ­تواند به مولکول دیگر حمله کند و با اکسایش آن مولکول خود را احیاء کند.

• • يک راديکال آزاد می ­تواند به يک مولکول ديگر اضافه شود و يک ترکيب راديکالي ايجاد کند. به عنوان مثال راديکال هيدروکسيل مي‌تواند به گوانين موجود در DNA اضافه و سبب ايجاد راديکالي به نام 8- هيدروکسي‌گوانين^[7] شود.

• • يک راديکال آزاد مي­تواند اتم هيدروژن را از پيوند هيدروکربني (C-H) برداشته و اسکلت کربني را با يک الکترون جفت نشده باقي بگذارد که در سیستم موجود زنده با یکسری واکنش­های زنجیره­ای همراه است(Pryor, 1984).

1-2-3- گونه­هاي فعال اکسيژن و نیتروژن
اصطلاح گونه­هاي فعال اكسيژن به راديكال‌هاي آزاد اکسيژن يا انواع فعال شده اكسيژن اطلاق مي‌شود. اکسیژن برای حفظ عملکرد سلول­های طبیعی هوازی مانند اسپرماتوزوآ لازم است. شکست محصولات گونه­ های اکسیژن فعال(ROS) می ­تواند به عملکرد و بقا سلول آسیب رساند(Eve de Lamirande & Gagnon, 1995).
گونه­ های فعال اكسيژن شامل یک طبقه بندی گسترده از جمله : رادیکال­ها (یون هیدروکسیل، سوپراکسید،اکسید نیتروژن، پراکسیل وغیره) و غیررادیکال­ها(ازن، اکسیژن تنها ، پراکسیدلیپید، پراکسید هیدروژن) و مشتقات اکسیژن می­باشند(Sikka, 2001).
همچنین گونه­ های فعال نیتروژن شامل: (نیتروژن اکسید، نیتروکسیل ، یون پراکسیدنیتریل وغیره) رادیکال­های نیتروژن آزاد در نظر گرفته شده و زیر کلاس گروه ROS قرار می­گیرند(Darley-Usmar, Wiseman, & Halliwell, 1995).
1-2-3-1- نقش­های بیولوژیک ROS
از نقش­های مهم ROS می­توان به موارد زیر اشاره کرد: به عنوان پیامبر­های درون سلولی عمل کرده و در مسیرهای تنظیم­کننده­ سلول فعال­ است، همچنین تنظیم بیان ژنی به­ ویژه ژن مربوط به پروتئین­های آنتی­اکسیدانی را بر عهده دارند(Finkel, 1998; Jones, Hancock, & Morice, 2000). مطالعات زمینه­ای نشان می­دهد ROS در تنظیم بلوغ اسپرم و فسفریلاسیون پروتئین­های انزالی در آغاز تحریک اسپرم نقش مهمی دارد(R. Aitken & Vernet, 1997). بنابراین، حضورROS برای عملکرد عادی سلول­ها ضروری به نظر می­رسد و با توجه به غلظتشان می­توانند اثرات فیزیولوژیک یا پاتولوژیک بر اسپرم داشته باشند.
1-2-4- تولید و منبع رادیکال­های آزاد
عوامل متفاوتی با منشا داخلی و خارجی می­توانند سبب تولید رادیکال آزاد در بدن شوند که این منابع شامل موارد زیر می­باشد:

• • التهاب و آلودگي­هاي ميکروبي منجر به توليد راديکال­هاي آزاد توسط نوتروفيل­ها و ماکروفاژها مي­شوند.

• • واکنش­های اکسیداسیون احیاء (انتقال الکترون) در میتوکندری: از طریق آنزیم­ های کاتالیز شده و همینطور انتقال یون­های فلزی کاتالیز کننده همانند یون­های آهن و مس، سبب تولید رادیکال­های آزاد اکسیژن به عنوان محصول فرعی می شوند.

• • آلودگی هوا (مواد شیمیایی موجود در هوا)، آتش سوزی جنگل، فعالیت­های آتشفشانی و سوزاندن ترکیبات آلی طی آشپزی نیز تولید رادیکال­های آزاد را سبب می­شوند.

• • تشعشع پر انرژی یا یونیزه شده مانند UV، ماکروویو، پرتوهای X و گاما، مصرف الکل و داروهای خاص، استعمال دخانیات، فاضلاب­های صنعتی، پنبه نسوز، علف کش­ها، سموم قارچی، مواد شیمیایی مازاد و استرس، از جمله عوامل دخیل در تولید رادیکال­های آزاد به ویژه ROS می­باشند(Agarwal & Allamaneni, 2011).

مایع منی شامل انواع مختلف سلول­ها ماننداسپرم بالغ و نابالغ، سلول­های گرد از مراحل مختلف اسپرماتوژنز، لکوسیت­هاوسلول­های اپی تلیال می باشد. از بین این سلول­های مختلف لکوسیت­هاواسپرماتوزوآی نابالغ به عنوان دو منبع اصلی تولید گونه­ های فعال اکسیژن شناخته شده ­اند(Garrido, Meseguer, Simon, Pellicer, & Remohi, 2004).
1-2-4-1- تولید ROS توسط اسپرماتوزوآی غیر طبیعی
تولید ROS در اسپرم غیر طبیعی به دلیل حفظ سیتوپلاسم اضافی در روند اسپرمیوژنز است که به دو روش ROS را تولید می­ کنند:
سیستم NADPH اکسیداز که در سطح غشای پلاسمایی اسپرم فعال است.
NADH اکسیدوردوکتاز که در سطح میتوکندری وجود دارد(R. J. Aitken, Buckingham, & West, 1992).
1-2-4-2- تولید ROS توسط لکوسیت­ها
توانایی لکوسیت­ها در تولید ROS به میزان فعالیت آن­ها در پاسخ به تحریکات از جمله التهاب و عفونت بستگی دارد(F. F. Pasqualotto, Sharma, Nelson, Thomas Jr, & Agarwal, 2000). لکوسیت­ها در برابر این تحریکات فعال شده، تولید NADPH افزایش یافته و در پی این فرایند، سطح ROS افزایش می­یابد(Blake, Allen, & Lunec, 1987).
1-2-5- استرس اکسيداتيو
استرس اکسيداتيو (OS) عبارتست از عدم تعادل بین ROS و آنتی­اکسیدان­ها در بدن که سبب پراكسيداسيون ماكرومولكول‌هاي داخل سلول شده و منجر به اثرات ثانويه بر عملكرد سلول مي­شود. رادیکال­های آزاد مانند ROS عاملی برای ایجاد استرس اکسيداتيو می­باشند و می­توانند سبب آسيب­های اکسيداتيو شوند(Griveau & Lannou, 1997).
1-2-5-1- مکانیسم عملکرد استرس اکسیداتیو
پس از القاء ROS و استرس اکسیداتیو 3 اتفاق در سلول می­افتد:
القاء ROS می ­تواند موجب بیش از 20 نوع آسیب در DNA شود. عدم ترمیم صحیح DNA توسط سیستم­های ترمیم ^[8]BER، ^[9]NER می ­تواند باعث جهش ژن مانند جهش نقطه­ای و پلی مورفیسم شود که می ­تواند موجب تغییر در عملکرد و بیان ژن­ها شود(Barroso, Morshedi, & Oehninger, 2000). شایع­ترین آسیب­های DNA آن موجب تبدیل ترکیب گوانین سیتوزین به آدنین تیمین می­ شود(Kemal Duru, Morshedi, & Oehninger, 2000).
اگر شکست در دو رشته DNA اتفاق بیفتدژن (^[10]ATM) که محصول آن یک پروتئین کینازسرین / ترئونین است فعال شده، در نتیجه منجر به توقف چرخه سلولی، تعمیر DNA به وسیله سیستم­های ترمیم ^[11]NHEJ و ^[12]HR می­ شود.
گاهی آسیب به حدی زیاد است که سیستم­های ترمیم DNA قادر به ترمیم آن نبوده و باعث القاء آپوپتوز و مرگ سلول آسیب دیده می­ شود(Wells et al., 2009). (شکل 1-1).
آسیب DNA
استرس اکسیداتیو
ترمیمDNA
آپوپتوز
شکل(1-1): ارتباط بین ATMو P53 در پاسخ­های ترمیم DNA یا آپوپتوز حاصل از آسیب ایجاد شده توسط استرس اکسیداتیو.
از علل احتمالی آسیب به DNAی اسپرم می­توان به آپوپتوز ناقص ، عفونت بیضه، اسپرماتوژنز معیوب و استرس اکسیداتیو اشاره نمود(Bhuller & Wells, 2006).
1-2-5- اثرات استرس اکسیداتیو
تمام اجزای سلولی ازجمله چربی­ها، پروتئین­ها، اسیدهای نوکلئیک و قندها از اهدف­ استرس اکسیداتیو هستند. میزان آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو به مقدارROS درگیر شده و عوامل خارج سلولی مانند دما، فشار اکسیژن و ترکیبات محیط اطراف از جمله یون­ها، پروتئین­ها و جاذب ROS بستگی دارد(Cocuzza, Sikka, Athayde, & Agarwal, 2007).
1-2-5-1- استرس اکسیداتیو و آسیب به DNA
آسیب DNA اسپرم به دو صورت می­باشد:
آسیب­ها­ی تک رشته DNA که اشعه­ها­ی یونیزان و اختلال در بازسازی DNA اسپرم این نوع آسیب­ها را ایجاد می­ کنند.
آسیب­ها­ی دو رشته­ای DNA که فعالیت کاسپا­زها و آندونوکلئاز­ها و اثر مستقیم^[13]ROS بر رشته DNA علت این نوع آسیب­ها در دو رشته DNA می­باشند و منجر به آپپتوز ناقص می­شوند(Sakkas & Alvarez, 2010).
اولین گزارش منتشر شده در مورد اثرات ROS بر روی اسپرم، نیم قرن پیش بوده است. تولید بیش از حد ROS سبب پراکسیداسیون لیپیدی، آسیب به DNA و کاهش ظرفيت توليدمثل^[14]می­ شود(Makker, Agarwal, & Sharma, 2009).