بزرگ را از طریق اختلال در متابولیسم تحت تاثیر فرار دهند.(یونجون کیم وهمکاران^[۶۸]،۲۰۱۳ ) سایر عوامل خطر شامل چاقی،عدم فعالیت ،سیگار،مصرف الکل و همچنین رژیم غذایی با فیبر کم می باشد.(نایجل هال،۲۰۱۱) در ایران نیزرشد سریع سرطان کولورکتال می تواند ناشی از تاثیر عوامل محیطی از جمله عادات غذایی خاص مانند افزایش مصرف کربوهیدرات ها و چربی ها و کاهش مصرف فیبر به ویژه درجوانان، تغییر سبک زندگی، عدم تحرک کافی و چاقی، جوان بودن اکثریت افراد جامعه و احتمالاً دخالت مسائل ژنتیکی باشد.(کامران مشفقی و همکاران،۱۳۸۹)
۱-۳-۷ درمان های رایج سرطان کولورکتال
بزرگترین مشکل سرطان کولورکتال توانایی بالا ان به شکل تومورهای ثانویه به خصوص در کبد و ریه می باشد.بر اساس مطالعات مختلف ؛در ۲۰ درصد از بیماران متاستاز در مراحل اولیه شناسایی تومور و در بیش از ۳۰ درصد همزمان باپیشرفت بیماری گسترش می یابد.عارضه دیگر مرتبط با سرطان کولورکتال ناهمگونی زیاد تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی در میان تومورهای انفرادیست.(پاول پیتوله و هکاران،۲۰۱۳) از انجایی که علائم بیماری متفاوت و گسترده می باشد و همچنین بیماری می تواند در مراحل مختلف باشد ،روش های درمانی نیز می توانند متعدد و بر اساس شرایط باشند.انچه که بیش از همه نوع درمان را تعیین می کند، مرحله ایی است که بیماری در ان قرار دارد. واضح است که اگر بیماری در مرحله صفر ویا حتی در مرحله یک و دو باشد تنها برداشتن بافت درگیر از طریق عمل جراحی کفایت می کند؛ اما هنگامی که بیماری قسمت های مختلف را در گیر کرده است ، یک نوع درمان پاسخگو نخواهد بود لذا باید از روش های مختلف درمانی بهره گرفت.معمولا درمان این سرطان نیازمند یک تیم پزشکی که شامل متخصص داخلی و انکولوژیست هست می باشد.سایر اعضا بسته به شرایط بیماری می توند جراح و متخصص رادیوتراپی باشند.لازم به ذکر است درمان های ارائه شده اغلب مرحله ایی بوده و هر مرحله مقدمه ایی را برای مرحله بعد فراهم می سازد .با این مقدمه متوجه این نکته می شویم مراحل درمان زمان بر و متفاوت می باشد و از پیچیدگی های خاصی برخودار است.روش های درمانی رایج عبارتند از :

الف-جراحی : در حال حاضر، عمل جراحی هنوز هم نقش غیر قابل جایگزینی در درمان سرطان کولورکتال ایفا می کند زیرا بدون توجه به ویژیگی های بیولوزیکی و مولکولی تومور، تمام حجم تومور اولیه یا ثانویه را بر می دارد..(پاول پیتوله و همکاران،۲۰۱۳) در سرطان کولون اگر بیماری در مرحله یک تا سه باشد درمان جراحی اولویت دارد. در این روش ناحیه ازرده روده برداشته می شود که این کار از انسداد ، خونریزی و پیشرفت بیماری تا حدودی جلوگیری می کند و علاوه بر ان زمینه را مناسب می سازد تا روش های دیگر درمان به راحتی اجرا شود.(محمدرضا زالی،۱۳۸۴) البته ایجاد عمل جراحی که پس از ان شیمی درمانی سیستماتیک صورت پزیرد گزینه مناسبی می باشد(جی مولسوو و هکاران^[۶۹] ،۲۰۱۲)
ب-شیمی درمانی : همانطور که اشاره شد درمان سرطان کولورکتال چند مرحله ایست بنابراین اگر در ابتدا عمل جراحی صورت پزیرد متعاقب ان نیازمند استفاده از شیمی درمانی وگاهی رادیوتراپی می باشیم. شیمی درمانی اگرچه با عوارض همراه است،ولی نسبت به اثری که دارد انجام ان با ارزش می باشد.شیمی درمانی معمولا به صورت دوره های درمانی و هر چند یک هفته یکبار انجام می شود و چند مرحله به طول می انجامد.(محمدرضازالی،۱۳۸۴)رایج ترین روش شیمی درمانی که برای درمان سرطان کولورکتال به کار می رود ، برپایه ۵ فلوئورو اوراسیل ، مشتقاتی از پلاتین فعال شده (اوگزاپلاتین^[۷۰]) و ایرینوتکان (به عنوان مهر کننده انزیم هسته ایی توپوایزومرازΙ) می باشد.(پاول پیتوله و همکاران^[۷۱]،۲۰۱۳) البته به تازگی طیف وسیعی از شیمی همراه استcetuximaدرمانی را که با درمان های بیولوژیکی که با انتی بادی مونوکلونال
مورد استفاده قرار می گیرند.رویکردهای درمانی جدید، رسپتور فاکتور رشد اپی درمی را مورد هدف قرار دادهاند؛ چون در اغلب تومورها، این رسپتور ها حالت جهش یافته و بیش بروز یافته پیدا می کند و سبب القاء تکثیر و تزاید، آنژیوژنز، تهاجم و متاستاز دور دست تومور می شود .مهارمسیر انتقال پیام رسپتور فاکتور رشد اپیدرمی در خارج سلول به وسیله آنتی بادی های پیشرفته ترین مونوکلونالآنتــی بــادیضدرسپتور Cetuximab. اختصاصی صورت می گیرد
فاکتور رشد اپی درمی در طول تکامل درمانی می باشد.این دارویک مونوکلونال آنتی بادی است که به زنجیره خارج سلولی گیرنده فاکتور رشد اپی درمی متصل می شود و نشان داده شده است که برای درمان سرطان کولورکتال متاستاتیک، بعد از شکست درمانهایاستاندارد مؤثر می باشد . (محسن رضوی و همکاران ،۱۳۸۷)
پ-درمان با اشعه یا رادیوتراپی : این روش درمانی در مورد رکتوم و بخشی از کولون که بافت های مجاور تهاجم یافته و از طریق شیمی درمانی و یا عمل جراحی قابل درمان نیست مورد استفاده قرار می گیرد..اثار این روش مطلوب بوده و توسط متخصص رادیوتراپی ارائه می شود .(محمدرضازالی،۱۳۸۴)
۱-۴ مسأله ی تحقیق
ALCAM یک گلیکوپروتئین گذرنده از غشا از خانواده ایمنوگلوبولین ها می باشد که از سه ناحیه خارج سلولی،گذرنده از غشا و سیتوپلاسمی تشکیل شده است.ناحیه خارج از سلولی این پروتئین از پنج دومین ایمنوگلوبین از نوع V و C2 تشکیل شده است .این پروتئین به عنوان یک موکلول چسبنده سلولی در مهاجرت سلولی نقش دارد هم چنین در تعاملات سلول –سلول دو نوع واکنش هتروفیلیک و هموفیلیک برقرار می کند.در تعامل هموفیلیک واکنش ALCAM-ALCAM و در تعامل هتروفیلیک با CD6 واکنش می دهد. دومین V این پروتئین از دو قسمت V1 وV2 شده است که به وسیله یک ناحیه کوتاه امینو اسیدی به هم متصل شده اند.در مطالعاتی که جهت تهیه نقشه خانواده مولکلوهای ایمونوگلوبولین چسبنده سلولی ((Igfs صورت گرفته مشخص شده است که بیشترین مقدار اتصال به لیگاند مربوط به دومین های V می باشد. و در واقع مطالعات صورت گرفته براهمیت وجود ناحیه V در ایجاد واکنش های این پروتئین تاکید کرده اند.(گیادو استوارت و همکاران ۲۰۲۰)از انجایی که مشخص شده گلیکوزیلاسیون بروی خاصیت تعامل هموفیلیک این پروتئین نقشی ندارد بنابراین انتخاب میزبان پروکاریوتی می تواند گزینه مناسبی جهت بیان پروتئین باشد.
همچنین این پروتئین به عنوان مارکر سطحی سلول های بنیادی سرطان کولورکتال معرفی شده است.(مایکل تاچزی و همکاران،۲۰۱۲) برسی الگوی بیان این پروتئین در سلول های نرمال و سرطانی روده از افزایش قابل توجه بیان این مارکر بر سطح سلول های سرطانی دارد که این مطلب می تواند از نقش بالقوه این مارکر به عنوان کاندیدایی جهت کارهای درمانی باشد. بررسی صورت گرفته از بیان بالای این مارکر در مراحل اولیه شکل گیری سرطان در موش حکایت داشت هم مشخص شده است که این بیان مارکر در سرطان کولورکتال و مرحله متاستاز حفظ می شود.(لوین و همکاران،۲۰۱۰)
درطول شکل گیری ضایعات توده ، سلول های سرطانی باید به یکدیگر متصل شوند بنابراین از مولکول های چسبنده برای اینکه با هم بمانند استفاده می کنند.تومور می تواند از طریق افزایش حجم خود به ساختارهای مجاور به طور مستقیم هجوم برده و یا اینکه می توانند سایت های دور متاستاز شوند.متاستاز هنگامی رخ می دهد سلول ها از تومور اولیه جدا شده و محیط خودشان را ترک کرده ، به رگ های خونی یا لمفاتیک حمله کرده و به مکان های دور مهاجرت کنند.با توجه اهمیت این پروتئین در چسبندگی سلول ها می توان نقش مهمی را برای این پروتئین در ایجاد متاستاز در سرطان کولورکتال قائل بود(سالمون اوفوری و جودی کینگ،۲۰۰۸) )
همانطور که اشاره شد این پروتئین به عنوان مارکر سلول های بنیادی سرطان می باشد، سلول های بنیادی به عنوان زیر گروه کوچکی از سلول های سرطانی می باشند که توانایی زیادی در خود تجدیدی دارند و توضیح دهنده این مطلب می باشند که چرا در بسیاری از سرطان ها پس طی مراحل درمانی بیماری دوباره عود می کند.از طرفی این پروتئین با توجه به اینکه یک پروتئین سطحی می باشد می توانند همانند دیگر پروتئین های غشایی به عنوان هدفی برای درمان سرطان مورد استفاده قرار گیرد.در این مطالعه ما در نظر داریم با آنالیز بیوانفورماتیکی ، کلونینگ و بیان ناحیه V پروتئین غشایی ALCAM، پتانسیل موجود برای بهبود روش های تشخیصی مثل تولید کیت های تشخیصی جهت تشخیص زودهنگام و پیش از بدخیم شدن سلول های سرطانی کولورکتال و همچنین گشایشی در تولید واکسن علیه سرطان کولورکتال را بررسی کنیم
در این مطالعه فرضیه های زیر مطرح شد.
الف-ناحیه VپروتئینALCAMرا می توان با بهره گرفتن از علم بیوانفورماتیک آنالیز کرد.
ب- ناحیه سنتز شده می تواند در میزبان مناسب کلون و بیان شود.
فصل دوم : مروری بر کارهای انجام شده
در سرطانALCAM (CD166) ۲-۱
نیز نشان دهنده یک هدف بالقوه درمانی می باشد.(ALCAM همانند دیگر پروتئین های غشایی
مایکل تاچزی و همکاران^[۷۲]،۲۰۱۲)
کلونینگ و بیان این پروتئین در سال ۱۹۹۵ توسط مایک بوون و همکارانش شرح داده شد.انها متصل CD6 به عنوان یک پروتئین ایمنوگلوبولین به CD166 نشان دادند که انتی بادی های
می گردد .(مایکل بوون و همکاران ^[۷۳]،۱۹۹۵؛ مایکل بوون و اروفو^[۷۴]،۱۹۹۹)
CD166 نقش بسیار مهمی در تهاجم توموری دارد.(جیاجی وانگ و همکاران^[۷۵]،۲۰۱۱)
چندین روش مبتنی بر روش های ژنومیک و پروتئومیکس این پروتئین را به عنوان یک هدف مرتبط با سرطان معرفی کرده اند.این پروتئین هم چنین توسط چندین گروه به عنوان انتی ژن سطحی سلول های بنیادی سرطان کولورکتال شناسایی شده است.(اولریچ وایدله وهمکاران ،۲۰۱۰ )
در ازمایشات صورت گرفته مرته تونه و همکارانش در شرایط ازمایشگاهی و هم چنین محیط زنده، انتی بادی های ضد این مارکر اثر مهارکننده ایی بر سرطان کولورکتال از خود نشان دادند.در ازمایش انها رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیایی^[۷۶] برای این مارکر در تومور مثبت بود در ALCAM صورتی که در اکثر تست هایی که بروی بافت های طبیعی انسان صورت گرفته بود
مشاهده نشد. با توجه به منفی بودن رنگ امیزی بافت نرمال انسان و مشاهده فعالیت ضد توموری
یک کاندیدای بالقوه جهت scFv این مارکر بر سرطان کولورکتال در داخل بدن انتی بادی
درمان سرطان کولورکتال معرفی گردید.(مرته تونه و همکاران^[۷۷]، ۲۰۱۰)
هم چنین الگوی بیان این مارکر در بافت نرمال و توموری ، روده انسان وموش با بهره گرفتن از روش های ایمنوهیستوشیمی،فلوسیتومتری^[۷۸] و واکنش زنجیره ایی پلی مراز ترانس کریپتاز را به ALCAMمعکوس^[۷۹] مورد بررسی قرار گرفت..در نهایت پس از بررسی صورت گرفته
عنوان یک مارکر بالقوه جهت اهداف درمانی برای سرطان کولورکتال معرفی کردند.(لوین و همکاران^[۸۰] ،۲۰۱۰)
بیان ALCAM مارکر تشخیصی مثبتی برای بقای کلی بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال می باشد و شناسایی ان ممکن است به بهینه سازی سیتسم مرحله بندی تشخیصی موجود کمک کند .افزایش بیان در تومورهای با تمایز بالا ممکن است مشخص کننده نقش بالقوه این مارکر در مراحل اولیه تومورزایی باشد،از دست دادن این پروتئین نیز ممکن است با کاهش چسبندگی سلولی همراه شود ، نتیجه پتانسل بالقوه بالای تومور در متاستاز خواهد بود.این نتایج از طریق انالیز ایمنوهیستوشمیایی ALCAM که بروی نمونه بافتی بیماران تحت درمان صورت گرفته بود بدست امد.(مایکل تاچزی و همکاران، ۲۰۱۰؛ سالمون اوفوری و جودی کینگ^[۸۱]،۲۰۰۸ )
در مراحل اولیه بیماری می تواند به عنوانALCAMهمچنین مشخص شده است که ریزش
یک مارکر تشخیصی دقیق برای شناسایی سریع بیمارانی که در معرض خطر پیشرفت بیماری هستند مورد استفاده قرار گیرد.(اماندا هنسن و همکاران^[۸۲] ، ۲۰۱۳)
در دو نوع تعامل سلول –سلول هموفیلیک ^[۸۳]و ALCAMاین نکته مشخص گردیده است که
هتروفیلیک^[۸۴] به عنوان میانجی عمل می کند.. مشخص شده گلیکوزیلاسیون^[۸۵] پس از ترجمه هیچ اثری بروی خاصیت اتصالی هموفیلیک ندارد.(گیادو اسوارت^[۸۶]،۲۰۰۲)
را برای هر دونوع تعامل هموفیلیک و Vمطالعات تهیه نقشه عملکردی دومین ها حضور دومین
هتروفیلیک ضروری دانست.(مایکل بوون و همکاران^[۸۷]،۱۹۹۶)
در مطالعاتی که جهت تهیه نقشه خانواده مولکلوهای ایمونوگلوبولین چسبنده سلولی ((Igfs صورت گرفته مشخص شده است که بیشترین مقدار اتصال به لیگاند مربوط به دومین های V می باشد.) گیادو اسوارت و همکاران ،۲۰۰۲ ؛ کوین زن وهمکاران^[۸۸]،۱۹۹۹)
منجرEpCAMhigh/CD44+تجزیه و تحلیل سلول هایی با مجموعه مولکول های سطحی
به عنوان مارکر بیانی اضافی متفاوت، که جهت جداسازی سلول های بنیادی CD166به شناسایی
سرطان در سرطان کولورکتال مفید می باشد شد.(پیه رو دالربا و همکاران^[۸۹] ،۲۰۰۶)
هم چنین پیشنهاد شده است که CD166 به همراه CD44 نیز می تواند نقش بالقوه ایی در سرطان کولورکتال انسانی ایفا کند زیرا سلول های موشی که برای هر دوی این ماکر ها مثبت بودند تومورزایی بسیار بیشتری در مقایسه با سلول هایی که تنها برای CD44 مثبت بودند داشتند.(کاترینا فانالی و همکاران^[۹۰] ،۲۰۱۴)
در بیشتر مطالعاتی که اخیرا بروی بافت های سرطان کولورکتال صورت گرفته گزارش شده است که از دست دادن غشایی CD166 و CD44 استاندارد(CD44s) با تهاجم و بدتر شدن وضعیت بقا در ارتباط می باشد.(توماس برونر و همکاران^[۹۱] ،۲۰۱۲)
هم چنین ترکیب مارکرهایCD166،CD44 و CD133 می تواند به طور موفق امیزی جهت شناسایی بیمارانی که خطر متاساز و عود بیماری در انها کم،متوسط و یا زیاد است در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال استفاده گردد.(یوسوکه شینوزووا و همکاران^[۹۲]،۲۰۱۳)
غالبا در سرطان کولورکتال روشنALCAMهمچنین در طی ازمایشی دیگری مشخص شد که
) بوده و مارکر تشخیصی مستقل جدیدی می باشد ، که بر اهمیت ان در پیشرویUpregulated(
تومور در سرطان کولورکتال تاکید شده است.( ویچرت و همکاران^[۹۳]،۲۰۰۴)
بر اساس تحقیقی دیگری که بروی بیان CD166 صورت گرفت مشخص شد که موقعیت های مختلف سلولی این پروتئین ارزش تشخیصی متفاوتی دارند و بیان سیتوپلاسمی ان با نتایج تشخیصی بدتری همراه می باشد. هم چنین اینها متوجه شدند که بیان CD166 به صورت خاصی در انواع رده های توموری افزایش پیدا می کند.(چائو نی و همکاران^[۹۴]،۲۰۱۳)
بیان بالای CD166 به همراه P21 در نمونه برداری های قبل درمان با عود تومور و پیش بینی ضعیف در بیماران درمان شده با ۵-FU بر پایه شیمورادیوثراپی قبل عمل ارتباط داشت.البته برای تعیین نقش CD166و P21 به عنوان نشانگرهای پیش بینی به پاسخ شیمورادیوتراپی قبل از عمل جراحی به مطالعات بزرگتر و کابردی تری در اینده نیاز می باشد.(سانگ هون سیم و همکاران^[۹۵]،۲۰۱۴)