به صورت منفرد و در ترکیب با هم بر روی مخمرهای مهم پزشکی
 

استاد راهنما
 

دکتر فاطمه زابلی
 

استاد مشاور:
 

دکتر مازیار شریف زاده
 

تابستان 93
 

                                                             فهرست مطالب
  عنوان                                                                                                                       صفحه
چکیده 1         
فصل اول: کلیات تحقیق . 2
1-1-.مقدمه 3
1-2- نانوتکنولوژی . 5
1-2-1- مفهوم و کاربردها 5
1-2-2- مزایا استفاده از نانو ذرات 6
1-2-3- کاربردهای نانوذرات در دارورسانی 6
1-2-4- حمل داروهای ضد عفونت 7
1-3- نانو ذرات کیتوزان . 7
1-3-1- کیتین و کیتوزان . 7
1-3-1-1- تاریخچه تولید کیتوزان 9
1-3-1-2-.کاربردهای کیتوزان 9
1-3-1-2-1-. خو.اص ضد میکروبی کیتوزان . 10
1-3-2- انواع روش های تولید نانوذرات کیتوزان 10
1-3-2-1- روش ژل شدن یونی. .           10
1-3-2-2- روش جداسازی فازی در محیط آب با بهره گرفتن از روش رسوب دهی 11
1-3-2-3- روش امولسیون ترسیبی .11      
 
عنوان                                                                                                                      صفحه
1-3-2-4- روش میسل معکوس. 12       
1-3-3- تعیین مشخصات نانو ذرات. 12       
1-3-3-1- میکروسکوپ الکترونی. 12       
1-3-3-2- دستگاه دی ال اس(زتا سایزر). 13       
1-4- بیماریهای قارچی فرصت طلب 14       
1-4-1- کاندیدا آلبیکنس 14
1-4-1-1- مورفولوژی و شناسایی 15
1-4-1-2- پاتولوژی 16
1-4-2- کاندیدا گلابراتا 17
1-4-2-1- موفولوژی و شناسایی 18
1-4-2-2- پاتولوژی 19
1-4-3- مالاسزیا فورفور. 19
1-4-3-1- موفولوژی و شناسایی 20
1-4-3-2- پاتولوژی 21
1-5- داروهای ضد قارچی و مکانیسم اثر آنها 21
1-5-1- مکانیسم داروهای ضد قارچی. 22
1-5-1-1- مکانیسم اثر ترکیبات آزول و عوارض. 23
1-5-1-2- فلوکونازول 23       
1-5-1-2-1-فعالیت ضد قارچی فلوکونازول در آزمایشگاه 23
 
عنوان                                                                                                                           صفحه
1-5-1-2-2- جذب فلوکونازول 24       
1-5-1-2-3-توزیع و جذب فلوکونازول. 24
1-5-1-2-4- متابولیسم و دفع فلوکونازول 24
1-5-1-2-5- اثرات جانبی فلوکونازول. 24
1-5-1-2-6- اشکال دارویی فلوکونازول 25
1-5-1-2-7- مصارف کلینیکی فلوکونازول. 25
1-5-1-3- کتوکونازول. 25
1-5-1-3-1- فعالیت ضد قارچی کتوکوکازول در آزمایشگاه. 25
1-5-1-3-2- جذب کتوکونازول. 26
1-5-1-3-3- متابولیسم و حذف کتوکونازول 26
1-5-1-3-4- اثرات جانبی کتوکونازول 26
1-5-1-3-5- اشکال دارویی کتوکونازول 27
1-5-1-3-6- مصارف کلینیکی کتوکونازول 27
1-5-2- مکانیسم مقاومت دارویی. 27
1-6- اندازه گیری فعالیت داروهای ضد قارچی در شرایط آزمایشگاهی. 30
1-6-1- انواع تست های حساسیت داروئی 31
1-6-2- روش های استاندارد تست های حساسیت داروئی . 33
فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده . 35
فصل سوم:مواد و روش ها 41
 
عنوان                                                                                                                          صفحه
3-1- تهیه مواد و ابزارها در تولید نانوذرات کیتوزان 42
3-2- تولید نانو ذرات کیتوزان. 43       
3-2-1- تهیه سود یک مولار. 43
3-2-2- تهیه محلول تری پلی فسفات سدیم 43
3-2-3- تهیه محلول استوک کیتوزان 43
3-2-4-تهیه نانو ذرات کیتوزان به روش ژلی شدن یونی. 43
3-2-5- استفاده از دستگاه دی ال اس. 44       
3-3- دستگاه ها و مواد مورد استفاده در تعیین حساسیت داروئی. 45
3-4- آماده سازی محیط کشت 46
3-4-1- تهیه محیط سابرود دکستروز آگار. 46
3-4-2- تهیه محیط سابرود دکستروز براث 46
3-4-3- تهیه محیط دیکسون آگار تغییر یافته. 47
3-4-4- تهیه محیط دیکسون براث تغییر یافته. 47
3-5- ارگانیسم های مورد استفاده. 48
3-5-1- تهیه کلنی کاندیدا آلبیکنس،کاندیدا گلابراتا،مالاسزیا فورفور بر روی محیط جامد. 48
3-5-1-1- تهیه سوسپانسیون از آمپول لیوفلیزه. 48
3-5-1-2- انتقال سوسپانسیون مخمری به محیط کشت جامد 48
3-5-1-3- تهیه کشت تازه و ساب کالچر. 49       
3-5-1-4- بررسی میکروسکوپی مخمرها با لاکتو فنل کاتن بلو. 49
 
عنوان                                                                                                                          صفحه
3-6- انجام تست حساسیت دارویی . 49
3-6-1- تهیه سوسپانسیون قارچی 49
3-6-2- تهیه محلول دارویی 50
3-6-3- تهیه محلول نانو ذرات کیتوزان. 51
3-7- انجام تست حساسیت دارویی از طریق MIC. 51
3-7-1- تعیین حساسیت مخمرهای مذکور نسبت به فلوکوناوزل،کتوکوناوزل،و نانو کیتوزان 51
3-7-2- تعیین حساسیت مخمری مذکور نسبت به ترکیب نانو کیتوزان با داروهای آزمون 52
3-8- خواندن نتایج MIC. 52       
3-8-1- خواندن نتایج MIC از طریق چشمی. 52
3-8-2- خواندن نتایج MIC از طریق دستگاه الایزا ریدر. 53
3-9- نتیجه گیری و مقایسه داده ها. 53
فصل چهارم: نتایج. 54
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری.71
پیشنهادات: .79
فهرست منابع فارسی: 80
فهرست منابع انگلیسی:82
چکیده انگلیسی:89
 
                                                            فهرست جداول
عنوان                                                                                                               صفحه
فصل سوم:مواد و روش ها. 41
جدول(3-1) دستگاه‏های مورد استفاده در تولید نانو کیتوزان. 42
جدول(3-2) مواد مورد نیاز در سنتز نانو کیتوزان. 42
جدول(3-3) دستگاه‏های مورد استفاده در تعیین حساسیت داروئی. 45
جدول(3-4) محیط کشت‏های مورد استفاده 45
جدول(3-5) مواد شیمیایی مورد استفاده. 46
جدول(3-6) مخمرهای مورد استفاده در آزمایش 48
فصل چهارم:نتایج. 54
جدول(4-1) نتایج اندازه گیری سایز نانو کیتوزان 55
جدول(4-2) نتایج حاصل از اندازه گیری پتانسیل زتا نانو ذرات کیتوزان. 56
جدول(4-3) شمارش تعداد CFU مخمرهای آزمون در برابر داروی فلوکونازول 58
جدول(4-4) تعیین میزان MIC50 و MIC90 داروی فلوکونازول در برابر مخمرهای مورد آزمون 58
جدول(4-5) شمارش تعداد کلنی مخمرهای در برابر کتوکونازول. 59
جدول(4-6) تعیین میزان MIC50 و MIC90 داروی کتوکونازول در برابر مخمرهای مورد آزمون 59
جدول(4-7)شمارش تعداد کلنی های CFU مخمرهای آزمون در برابر نانو کیتوزان. 60
جدول(4-8)تعیین میزان MIC50 و MIC90داروی نانو کیتوزان در برابر مخمرهای آزمون. .60
جدول(4-9) شمارش تعداد کلنی CFU مخمرهای آزمون در برابر اثر ترکیب نانوکیتوزان و فلوکونازول 61
جدول(4-10) تعیین میزان MIC50 و MIC90ترکیب نانو کیتوزان و فلوکونازول در برابر مخمرهای آزمون 61
جدول(4-11)شمارش تعداد کلنی CFU مخمرهای مورد آزمون در اثر ترکیب نانو کیتوزان و کتوکونازول. 62
جدول(4-12)تعیین میزان MIC50 و MIC90ترکیب نانو کیتوزان و کتوکونازول در برابر مخمرهای آزمون. 62       
 
عنوان                                                                                                                       فهرست
جدول(4-13) نتایج آزمون آنالیز واریانس برای مقایسه تعداد کلنی مخمرهای مورد آزمون در حضور داروهای مختلف به صورت تکی و در ترکیب. 63
جدول(4-14) نتایج آزمون آنالیز واریانس برای مقایسه تاثیر داروها بر مخمرهای آزمون. 67
جدول(4-15) مقایسه تعداد کلونی در غلظت های مختلف ترکیب نانو کیتوزان با گروه شاهد . 68
جد.ول(4-16) مقایسه تعداد کلونی در غلظت های مختلف ترکیب نانو کیتوزان و فلوکونازول با گروه شاهد. 69
جد.ل4-17)مقایسه تعداد کلنی در غلظت های مختلف ترکیب نانو کیتوزان و کتوکونازول با گروه شاهد 70
                                     فهرست نمودارها
عنوان                                                                                                                 صفحه
نمودار(4-1) محدوده جذب برای کاندیدا گلابراتا. 57
نمودار(4-2) محدوده جذب برای کاندیدا آلبیکنس 57
نمودار(5-2)محدوده جذب برای مالاسزیا. 57
                                       فهرست شکل ها
عنوان                                                                                                  صفحه
فصل اول:کلیات. 2
شکل(1-1)تبدیل کیتین به کیتوزان 8
شکل(1-2) واکنش بین کیتوزان و تری پلی فسفات سدیم. 11
شکل(1-3) موفولوژی کاندیدا آلبیکنس. 16
شکل(1-4) موفولوژی کاندیداگلابراتا 18
شکل(1-5)موفولوژی مالاسزیا فورفور. 20
فصل سوم:مواد و روش‏ها 41
شکل(3-1) مراحل تولید نانو کیتوزان 44
شکل(3-2) الف:اولتراسونیک ب:زتا سایزر ج:فریز درایر. 44
شکل(3-3) محیط کشت مورد استفاده. 47
شکل(3-4) محلول های داروئی در رقت های مورد نیاز. 50
شکل(3-5) میکروپلیت های 96 خانه ای 52
شکل(3-6) خواندن میکروپلیت 96 خانه ای توسط دستگاه الایزا ریدر. 53
شکل(3-7) پلیت های مخمرهای مورد آزمایش. 53
 
چکیده:
زمینه و هدف: با توجه به مقاومت مخمرهای بیماریزا به انواع آنتی بیوتیک ها و عوامل ضد میکروبی مرسوم،تحقیقات بسیاری برای یافتن انواع جدید عوامل ضد میکروبی موثر انجام شده است.هدف مطالعه حاضر تعیین فعالیت ضد قارچی نانو ذرات کیتوزان در حالت منفرد و در ترکیب با داروهای آزولی بر علیه برخی از مخمرهای مهم پزشکی می‏باشد
روش بررسی:در این مطالعه تجربی قارچ‏‏های کاندیدا آلبیکنس(ATCC5027)،کاندیدا گلابراتا(ATCC5297) و مالاسزیا فورفور(MF1) به عنوان میکروارگانیسم‏های مورد آزمایش استفاده شدند.نانو ذرات کیتوزان با بهره گرفتن از روش ژلاسیون یونی تولید شد و با بهره گرفتن از دستگاه زتا سایز اندازه سایزو پتانسیل زتا آن اندازه گیری شدفعاالیت ضد قارچی نانو ذرات و داورهای فلوکونازول و کتوکونازول یه صورت منفرد و در ترکیب با بهره گرفتن از تعیین حداقل غلظت مهار کننده رشد(MIC)به روش میکرو دایلوشن در دو محیط کشت سابررد دکستروز براث (برای همه قارچ به جز مالاسزیا)و دیکسون براث تغییر یافته (برای مالاسزیا)مورد بررسی قرار گرفت و مقادیرMIC50,و MIC90برای هر یک از ترکیبات بر اساس شمارش تعداد کلنی قارچی در مقایسه با گروه شاهد محاسبه شد.میزان شاخض غلظت مهاری (FIC) برای تعیین یا توضیح بر هم کنش نانو ذرات در حالت ترکیب با داروها مورد آزمایش استفاده گردید.و نتایج با بهره گرفتن از آزمون آنالیز واریانس و آزمون دانکن با سطح معنی داری 05/0 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
یافته ها: قطر نانو ذرات تولید شده در بررسی‏ها‏ی صورت گرفته در محدوده 251 نانومتر قرار دارد.نتایج نشان داد که نانو کیتوزان و داروهای مذکور از طریق وابسته به غلظت قادر به مهار رشد عوامل قارچی می باشند.به طوری که میزان MIC  داروی فلوکونازول برای کاندیدا آلبیکنس،کاندیدا گلابراتا و مالاسزیا فورفور به ترتیب برابر 16-128،4-64،4-32،میکروگرم در میلی لیتر و میزان MIC داروی کتوکونازول به ترتیب برابر،2-16،8-32،4-32 میکروگرم در میلی لیتر و میزان MIC نانو کیتوزان به ترتیب برابر،256-1024،512-1024،1024-4096 ،میکروگرم در میلی لیتر تعیین شد.و شاخص غلظت مهاری تنها در ترکیب نانو کیتوزان وفلوکونازول برابر با 1 و در بقیه ترکیبات بالاتر از 2 تعیین شد.نتایج حاصل ازشمارش کلنی ها  نسبت به گروه شاهد در هر یک از ترکیبات معنی دار بود (P<0.05).          
نتیجه گیری:طبق نتایج ذرات تولید شده در محدوده نانو قراردارد.همچنین این ذرات  دارای اثر ضد قارچی بر علیه مخمرهای مورد آزمایش در غلظت های مختلف بود.و