آب دو بار تقطیر
۳
۲/۳
SDS 10%
۰۳۷۵/۰
۰۶/۰
APS 10%
۰۳/۰
۰۶/۰
TEMED
۰۶/۰
۰۱۲/۰
۲-۷- آماده کردن نمونه‌ها به منظور تزریق بر روی ژل
۱) به تعداد نمونه‌هایی که با شتاب g3000 سانتریفوژ شده، ویال ۵/۰ میلی‌لیتری برداشته شد و شماره گذاری گردید.
۲) از سطح بالایی مایع درون ویال‌های سانتریفوژ شده، ۵۰ میکرولیتر نمونه داخل ویال ۵/۰ ریخته شد.
۳) در یک ویال دیگر ۳۰۰ میکرولیتر از بافر نمونه با ۹ میکرولیتر مرکاپتواتانل مخلوط گردید و از این ویال ۲۵ میکرولیتر به ویال‌های حاوی مایع رویی اضافه شد.
۴) همگی ویال‌ها ورتکس شده و ۵ دقیقه در آب جوش نگه داشته می‌شوند.
۵) از BLG طبیعی نوع A به عنوان شاهد استفاده شد. به منظور آماده کردن نمونه شاهد، ۱ میلی‌گرم از بتالاکتوگلوبولین توزین شده و در داخل ویال ریخته و با آب مقطر به حجم ۱ میلی‌لیتر رسانده شد. از این نمونه هم ۵۰ میکرولیتر برداشته و با ۲۵ میکرولیتر بافر نمونه آماده شده در مرحله ۳ مخلوط گردید. ورتکس و ۵ دقیقه نگه‌داری در آب جوش برای این نمونه نیز انجام شد.
۶) سپس با میکروپیپت ۳۰ میکرولیتر از هر ویال در داخل چاهک ریخته شد. باید دقت شود که محتوای هر چاهک وارد چاهک دیگر نشود و نمونه‌ها به گونه‌ای تزریق شود که خوب در چاهک ها بنشیند.
۷) سپس منبع برق را روشن کرده و جریان را به ازای هر ژل در قسمت پشته سازی ۱۰ میلی‌آمپر و در قسمت تفکیک کننده ۲۰ میلی‌آمپر تنظیم گردیده و ولتاژ را روی ۱۰۰ تنظیم شد.
۸)در حدود ۵/۱ ساعت زمان می‌برد تا نمونه‌ها مهاجرت کنند و به انتهای کاست برسند. هنگامی که رنگ آبی به انتهای کاست رسید جریان قطع می‌گردد.
۲-۸- روش رنگ آمیزی کوماسی‌بلو
۱) پس از اتمام الکتروفورز نمونه‌ها بر روی ژل، اسلایدهای شیشه‌ای را به آرامی از ژل جدا کرده و به منظور رنگ آمیزی با محلول کوماسی‌بلو در ظرف پلاستیکی قرار می‌دهیم.
۲) سطح ژل با محلول کوماسی‌بلو پوشانده می‌شود(بهتر است که تازه تهیه شود) و به مدت ۱ ساعت با دور آهسته بر روی شیکر قرار گرفت.
۳) پس از این مدت محلول کوماسی‌بلو دور ریخته و ژل با آب مقطر شست و شو داده شد.
۴) سپس محلول رنگ‌بر بر روی ژل ریخته شد به گونه‌ای که سطح ژل پوشانده شود و به مدت ۲ ساعت با دور آهسته بر روی شیکر قرار گرفت.
۵) بعد از این مدت محلول رنگ‌بر را دور ریخته و محلول رنگ‌بر تازه اضافه شد. این عمل را تا زمانی که باند‌های آبی نمایان شود و ژل دوباره شفاف شود ادامه می‌یابد. البته برای بهتر شفاف شدن ژل می‌توان با گذشت ۲ ساعت از ریختن محلول رنگ‌بر آن را تعویض کرد.
۶) در پایان هم می‌توان برای نگه‌داری ژل می‌توان از محلول اسیداستیک ۷% استفاده کرد.
۲-۹- خالص سازی BLG
مناسب‌ترین روش خالص‌سازی BLG که تمامی اهداف ما را در بر می‌گرفت روش آرمسترانگ و همکاران بود که بسیار دقیق و دارای محصول فراوان است. برای انجام این روش چندین محلول را باید از قبل آماده می‌کردیم.
۲-۹-۱- محلول سازی
۲-۹-۱-۱- اسید کلریدریک ۱ مولار
بدین منظور اسید کلریدریک بسیار غلیظ را که موجود است، طبق رابطه زیر به هر میزان که نیاز باشد رقیق می‌کنیم:
=
که در آن ، مولاریته اسید غلیظ و حجم آن و و به ترتیب مولاریته و حجم مورد نیاز اسید رقیق می‌باشد.
۲-۹-۱-۲- آمونیاک ۱ مولار
طبق رابطه بالا این محلول را نیز از آمونیاک غلیظ تهیه می‌نماییم.
۲-۹-۱-۳- بافر استات با pH 2/5
بدین منظور g33/16 سدیم استات (COONa ) سه آبه را با ۲/۳ میلی‌لیتر اسیداستیک ۱۷ مولار در یک لیتر آب مقطر حل می‌نماییم.
۲-۹-۲- تکنیک خالص سازی BLG
۱) ابتدا شیر تازه و گرما ندیده را تهیه نموده (در صورت گرما دادن به شیر جهت از بین بردن عوامل زنده شیر که برای جلوگیری از فساد آن انجام می‌شود، ممکن است بر اثر حرارات به پروتئین‌ها آسیب وارد شود).
در صورت نیاز به نگه‌داری این شیر می‌توان آن را در دمای ۲۰- نگه‌داری کرد.
