منابع تحقیقاتی برای نگارش مقاله مطالعه تنوع ژنتیکی لاین‌های‌خاص تولید شده در مرکز تحقیقات صفی آباد خوزستان- فایل ...

ارسال شده در 30 مهر 1400 توسط فاطمه کرمانی در بدون موضوع

متوسط

متحمل

*لاین‌های مربوط به دکتر برزگری، “لاین‌های مربوط به دکترآفرینش. رنگ‌های مشترک نشان دهنده یک شجره می‌باشد
۳-۲ مکان و زمان آزمایش
این تحقیق در سال ۱۳۹۳-۱۳۹۲ در دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان انجام شد.
۳-۳ استخراج DNA ژنومی
۳-۳-۳ ترکیبات بافر استخراج و ضرورت آنها
الف-^[۱۱۳]CTAB وEDTA2 : شکستن دیواره‌ی سلول‌ها در طی مرحله استخراج^[۱۱۴]توسط این دو ماده صورت می‌پذیرد. بافر CTAB سبب حذف غشای سلولی و مواد آبگریز موجود در محیط می‌شود. یون‌های دو ظرفیتی چون سبب حفظ یکپارچگی دیواره‌ی سلول‌های گیاهی می‌شوند، EDTA با کاتیون‌های دوظرفیتی Ca⁺² و Mg⁺² پیوند برقرار می‌کند که باعث بی‌ثباتی دیواره‌ی سلولی می‌شود. از سوی دیگر یون‌ها و فسفات‌های موجود در DNA به علت بار منفی و هم‌نام، یکدیگر را دفع می‌کنند)آیتکن و همکاران^[۱۱۵]، ۲۰۰۸).
ب- NaCl: وجود NaCl در بافر به دلیل آزاد کردن Na⁺ و ایجاد پیوند یونی بین Na+ و P^- سبب خنثی شدن بار منفی DNA و جمع شدن مولکول‌های آن در کنار هم می‌شود.
پ- مرکاپتواتانول^[۱۱۶]: به عنوان یک آنتی‌اکسیدان عمل می‌کند و مسیر تخریب و جداسازی پروتئین‌ها را هموار می‌کندآیتکن و همکاران، ۲۰۰۸).
ت- کلروفرم- ایزوآمیل الکل^[۱۱۷]: با اضافه کردن کلروفرم- ایزوآمیل الکل(۱:۲۴) پروتئین‌ها و لیپیدها از ماده‌ی وراثتی جدا می‌شوند.
ث- ایزوپروپانول^[۱۱۸]: ایزوپروپانول سرد نیز سبب رسوب DNA می‌شود. به جای ایزوپروپانول می‌توان از دو برابر الکل ۹۵ درصد استفاده نمود.
ج-الکل۷۰ درصد و استات پتاسیم ۵ مولار: جهت حذف باقی‌مانده‌های ترکیبات فنولی و یون‌های معدنی استفاده می‌شوند و به عبارتی این دو ماده جهت شستوی نهایی بکار می‌روند.
۳-۳-۲ استخراج DNA
استخراج DNA از نمونه برگی به روش(CTAB) انجام شد که جزئیات آن به شرح زیر است:
استخراج DNA از نمونه‏های برگی به روش CTAB(جکسون و همکاران^[۱۱۹]، ۱۹۹۹) انجام شد که جزئیات آن به شرح زیر است:
۱- ۲/۰ گرم از برگ(بدون رگبرگ) را وزن شده و به⁯ وسیله ازت مایع و با هاون چینی سرد شده پودر و به میکروتیوب ۵/۱ میلی⁯لیتر منتقل گردید.
۲- سپس ۸۰۰ ماکرو لیتر از بافر استخراج CTAB جدول(۳-۲) که قبلا در بن ماری ۶۵ درجه به مدت ۱۰ دقیقه گرم شده، همراه با ۴۰ ماکرولیتر PVP و ۲ ماکرو لیتر مرکاپتواتانول اضافه شد (این عملیات باید در زیر هود انجام شود چون مرکاپتواتانول شدیدا سمی است).
۳- نمونه‌ها به مدت ۶۰ دقیقه در حمام بن ماری در دمایC°۶۵ درجه سانتی‌گراد قرار داده شد و در این مدت هر ۵ دقیقه به آرامی سر و ته شدند.
۴- بعد از خارج کردن نمونه‌ها ۱۰-۵ دقیقه به نمونه‌ها اجازه دادیم تا خنک شوند.
۶- به میزان ۵۰۰ ماکرولیتر کلروفورم ایزوآمیل الکل(۱:۲۴) سرد به میکروتیوپ‌ها اضافه شده و به آرامی به مدت ۳۰ دقیقه میکروتیوپ‌ها واژگون شدند.
۵- عمل سانتروفیوژ به مدت ۱۰ دقیفه در دور۱۳۰۰۰انجام شد.
۷- فاز رویی^[۱۲۰] را با سمپلر کشیده شد و به میکروتیوب جدید منتقل شد.
۸- بسته به نیاز مرحله ۶ تا ۸ تکرار شد.
۹- برای رفع آلودگی RNA، مقدار ۱ میکرولیتر RNAase به هر میکروتیوب‌ها اضافه شده و به مدت ۱۵ دقیقه در حمام بن‏ماری قرار داده شدند.

۱۰- حجم ۶۰۰ میکرولیتر (هم‌حجم فاز رویی) ایزوپروپانول سرد به نمونه‌ها اضافه شده و به مدت ۳۰ دقیقه در دمایC°۲۰- قرار داده شدند.
۱۱- به منظور شتشو ۲۰۰ ماکرولیتراتانول ۷۰ درصد و ۲۰۰ ماکرولیتر استات آمونیوم ۵ مولار به نمونه‌ها اضافه شده و به مدت ۲۰ دقیقه در دمای اتاق نگهداری شدند.
۱۲- مرحله ۷ تکرار شد.
۱۳- رسوب به دست آمده به مدت ۱۵ دقیقه در هوای اتاق خشک شد.
۱۴- بسته به میزان رسوب DNA مشاهده شده، ۲۰۰ -۵۰ مایکرولیتر آب مقطر یا TE به نمونه‌‌ها اضافه شدند.
۱۵- نمونه‌های DNA استخراج شده ابتدا تا حل شدن کامل به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری و سپس به فریزر۲۰- منتقل شدند.
برای استخراج DNA ژنومی از روش CTAB تغییر یافته استفاده شد (جدول ۳-۲).
جدول ۳-۲ ترکیبات بافر استخراج CTAB