ترکیب ها

محیط کشت

محیط MS نیم غلظت با ۱ میلیگرم در لیتر ۲,۴-D، ۸ گرم در لیتر آگار، ۳۰ گرم در لیتر سوکروز و ۷/۵ = pH

محیط پیش کشت( محیط پیش آماده سازی)^[۵۰]

محیط LB

محیط کشت باکتری

محیط MS با ۳۰ گرم در لیتر سوکروز و ۷/۵ = pH

محیط مایه زنی

محیط MS با ۵/۰ گرم در لیتر تریپتون، ۱ میلیگرم در لیتر BA، ۱/۰ میلیگرم در لیتر NAA، ۸ گرم در لیتر آگار، ۳۰ گرم در لیتر سوکروز و ۱۰۰ میکرو مولار استوسیرینگون

محیط هم کشتی

محیط MS با ۱ میلی گرم در لیترBA، ۱/۰ میلیگرم در لیترNAA، ۴۰۰ میلی گرم در لیتر سفاتاکسیم و ۱۵۰ میلی گرم در لیتر کانامیسین

محیط گزینش

محیط MS با ۱ میلیگرم در لیتر BA، ۳/۰ میلیگرم در لیتر NAA، ۲۵۰ میلیگرم در لیتر سفاتاکسیم و ۱۵۰ میلیگرم در لیتر کانامیسین

محیط باززایی شاخساره

محیط MS نیم غلظت با ۱/۰ میلیگرم در لیتر NAA و ۵۰ میلیگرم در لیتر کانامیسین

محیط ریشه زایی

۳-۳-۳- آغازگرها

آغازگرهای مورد استفاده در واکنش زنجیره ای پلیمراز از شرکت تولیدی، پژوهشی
Metabion International AG کره جنوبی فراهم گردیدند. ترادف نوکلئوتیدی آغازگرهای استفاده شده در این بررسی به ترتیب زیر می باشد:
F GGTGGGAAAGCGTTACAAG
R TGGATTCCGGCATAGTTAAA

۳-۴- روش ها

۳-۴-۱- آماده سازی باکتری برای انجام انتقال ژن به ریزنمونه ها

از سویه A. tumefaciens strain LBA 4404 و پلاسمید pBI121 حامل ژن گزارشگر بتاگلوکورونیداز (uidA) تحت کنترل پیشبر CaMV35S ویروس موزاییک کلم گل و ژن گزینشگر انتخابی nptII استفاده شد (نگاره۱-۳). پلاسمید با روش ذوب و انجماد نیتروژن مایع وارد باکتری شد (سام بروک و همکاران^[۵۱]، ۱۹۹۸). یک همگروهه از باکتری مورد نظر در ۵ میلی لیتر محیط LB حاوی آنتی بیوتیک ریفامپیسین (۵۰ میلی گرم در لیتر) به مدت یک شب در ۲۸ درجه سلسیوس کشت داده شد. پس از رشد مناسب باکتری در ۴ درجه سلسیوس باrpm 3500 و به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی حذف و به رسوب به دست آمده ۱۰۰ میکرولیتر از محلول CaCl₂ (۲۰ میلی مولار) که از پیش گندزدایی و سرد شده بود، افزوده شد. سوسپانسیون به دست آمده به لوله اپندورف ۵/۱میلی لیتری منتقل شد. ۴-۳ میکرولیتر از پلاسمید pBI121 به آن افزوده شد. به آرامی سوسپانسیون موردنظر با پلاسمید آمیخته و در نیتروژن مایع قرار داده شد. اپندورف دارای آمیخته مورد نظر به مدت ۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سلسیوس قرار داده شد. سپس ۱میلی لیتر از محیط LB به آن افزوده و به مدت ۴ ساعت در ۲۸ درجه سلسیوس روی شیکر ۲۵۰ دور در دقیقه قرار داده شد.
۱- سوسپانسیون باکتری روی محیط جامد LB به همراه آنتی بیوتیک ریفامپیسین (۵۰ میلیگرم در لیتر) و کانامیسین (۵۰ میلیگرم در لیتر) کشت و در تاریکی در دمای ۲۸ درجه سلسیوس قرار داده شد.
۲- ۲ تا ۳ روز بعد، از کلونی های رشد یافته در محیط مایع LB دارای آنتی بیوتیک های ریفامپیسین و کانامیسین کشت داده شد. وجود پلاسمید در باکتری با انجام PCR و استخراج پلاسمید (نگاره۲-۳) تایید گردید (سام بروک و همکاران، ۱۹۸۹).. واکنش زنجیره ای پلی مراز با بهره گرفتن از آغازگرهای ژن GUS برای افزایش قطعه bp425 این ژن انجام شد.
نگاره۱-۳- جایگاه های برشی پلاسمید pBI121 (چن و همکاران، ۲۰۰۳).

۳-۴-۲- استخراج DNA پلاسمیدهای نو ترکیب

برای استخراج DNA پلاسمید نوترکیب از یاخته های باکتری از روش جوشاندن (استانگ و همکاران^[۵۲]، ۱۹۹۸) به صورت زیر استفاده گردید:
۱- ۵/۱ میلی لیتر محیط کشت LB مایع حاوی باکتری پس از گذشت یک شب در دمایC ^◦۳۷ در لوله اپندورف ۵/۱ میلی لیتری در rpm13000 به مدت یک دقیقه سانتریفیوژ شد.