.

جداسازی باکتری‌های سالمونلا، اشرشیاکلی و استافیلوکوک اورئوس

آماده‌سازی نمونه گوشت قرمز و سفید

ابتدا تیغ جراحی را با فرو بردن در الکل و شعله دادن سترون شد. زمانی که مقداری تیغ خنک شد یک لایۀ سطحی به ضخامت ۳mm از آن برداشته سپس دوباره تیغ را سوزانده و از عمق گوشت نمونه برداشته شد. بعد از توزین نمونه به اندازه ۲۵gr آن را به Zipekipe یا کیسه استومیکر ریخته و به اندازه ۹ برابر وزنش به آن محلول رقیق کننده اضافه می­گردد.

شمارش استافیلوکوک‌های کواگولاز مثبت در نمونه گوشت سفید وقرمز

تلقیح: با بهره گرفتن از پیپت سترون، ۰٫۱ml از سوسپانسیون اولیه را به پلیت حاوی محیط کشت Bird Parker Agar منتقل شد. این عمل تا ر قت ^۲-۱۰ تکرار شده، در هر مورد به صورت دوتایی کار شد. با دقت و تا حد امکان به سرعت، نمونه را به کمک میله شیشه‌ای در سطح محیط کشت پخش از تماس نمونه با جدار پلیت خودداری شد. پلیت‌ها به مدت زمان ۱۵ دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار گرفت تا مایع کشت داده شده جذب محیط کشت شود.
گرمخانه گذاری: پلیت‌ها به صورت وارونه به مدت زمان ۴۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سلسیوس گرمخانه گذاری شد. بعد از ۴۸ ساعت گرمخانه گذاری کلنی‌های مشخص به صورت کلنی‌های سیاه یا خاکستری براق و محدب به قطر ۱mm تا ۲٫۵mm که با هالهای شفاف درآمد.
تأیید آزمون کوارگولاز: با بهره گرفتن از یک حلقه کشت سترون از هر کلنی برداشته شد و به یک لوله آزمایش حاوی محیط کشت عصاره مغز و قلب منتقل گردید، سپس در دمای ۳۷ درجه سلسیوس به مدت زمان ۲۴ ساعت گرمخانه گذاری شد. سپس در شرایط سترون، ۰٫۱ml از سوسپانسیون فوق در لوله سترون به اندازه ۱۰x75ml ریخته و ۰٫۳ml پلاسمای خرگوش اضافه گردید و در دمای ۳۷ درجه سلسیوس به مدت زمان ۴ تا ۶ ساعت گرمخانه گذاری شد. سپس تشکیل لخته پلاسما بررسی می­شد. اگر نتیجه منفی بود تا مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای اتاق یا مدت زمانی که توسط تولید کننده پلاسما سفارش شده است نگهداری می­گردید. آزمایش کواگولاز در صورتی مثبت است که لخته تشکیل شده باشد. بعنوان شاهد برای هر بسته، ۰٫۱ml از محیط کشت عصاره سترون مغز و قلب به مقدار توصیه شده پلاسمای خرگوش افزوده و بدون افزودن سوسپانسیون، گرمخانه گذاری می­شد و در صورتی آزمایش معتبر می­شد که نشانه‌ای از لخته در پلاسمای شاهد دیده نمی­شد.

بیان نتایج: تعداد کلنی‌های مشاهده شده در آخرین رقت رشد کرده ضربدر عکس رقت در هر گرم
محیط مغز و قلب:
روش تهیه: محیط کشت آماده را که به صورت تجاری وجود داشت تهیه و طبق دستورالعمل کارخانه سازنده توسط آب مقطر ساخته شد. pH باید طوری تنظیم می­شد که پس از سترون کردن در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد، ۴/۷ باشد. محیط کشت در حجم‌های ۵ml تا ۱۰ml به لوله مناسب منتقل شده و به مدت زمان ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد، در اتوکلاو سترون گردید.
محیط برد پارکرآگار:
روش تهیه: محیط کامل که به صورت صنعتی آماده است توسط آب مقطر طبق دستورالعمل کارخانه ساخته شد. محیط آماده در ارلن‌های با گنجایش مناسب توزیع و سپس در اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سیلسیوس سترون گردید. pH آن طوری تنظیم شد که در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد pH آن برابر باشد. بعد از سترون کردن و خنک کردن محیط تا ۴۵ درجه سلسیوس یک معرف به نام اگیولک به آن اضافه شد. به ازای هر ۵۰۰cc، ۲۵cc از آن مصرف به محیط سترون شده اضافه شد. این کار بایستی در یک محیط سترون انجام می­گرفت. سپس محیط کامل در پلیت تقسیم می­شد.
پلاسمای خرگوش: به صورت تجاری وجود دارد.
آماده کردن پلیت‌ها: مقدار مناسبی از محیط کشت کامل به درون پلیت‌های سترون ریخته به گونه‌ای که ضخامت محیط کشت حدود ۴ml باشد و به حال گذاشته شد تا محیط ببندد. پلیت‌ها را می‌توان به مدت زمان ۲۴ ساعت در دمای ۳ درجه سلسیوس نگهداری نمود.

جداسازی سالمونلا در نمونه گوشت سفید و قرمز

پیش غنی سازی در محیط مایع غیر انتخابی: در این مرحله تلقیح کردن نمونه در Lactos Broth (این محیط به عنوان رقیق کننده استفاده می‌شود) و گرمخانه گذاری آن در دمای ۳۷ درجه سلسیوس به مدت زمان ۱۶ تا ۲۰ ساعت صورت گرفت. ضروری است قبل از کشت دادن، دمای محیط رقیق کننده به ۳۷-۳۰ درجه سلسیوس رسانده شود.
غنی سازی در محیط مایع انتخابی: تلقیح ۱ml کشت حاصل در محیط غیرانتخابی در محیط مایع Selenit enrichment که به صورت ۱cc در لوله آزمایش تقسیم شد و گرمخانه گذاری در دمای ۳۷ درجه سلسیوس به مدت زمان ۲۴ ساعت.
کشت در محیط جامع و شناسایی: از کشت حاصل بر روی محیط جامد انتخابی SS Agar کشت ۴ مرحله‌ای تهیه شد و به مدت زمان ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه گرمخانه گذاری گردید. نحوه کشت باید به گونه‌ای باشد که تک پرگنه‌های مشخص در سطح آگار ایجاد شود. پرگنه‌های موجود بر روی محیط SS Agar زرد با هاله مشکی است.
انتخاب پرگنه‌ها برای تأیید: از هر پلیت ۵ پرگنه انتخاب گردید و بر روی محیط مغزی Notriant Agar کشت داده شد و به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سلسیوس نگهداری و از کشت‌های خالص برای آزمون‌های تأییدی بیوشیمیایی و سرولوژیکی استفاده شد.
آزمون‌های بیوشیمیایی: به وسیله یک سر سوزن حلقه کشت از پرگنه‌های مورد نظر برداشته و در محیط‌های مشروح کشت داده شد.
محیط TSI Agar: با بهره گرفتن از کشت که به پرگنه‌های مورد نظر آغشته بود ابتدا سطح مخزن مایل محیط به صورت خطی کشت داده شد آنگاه سوزن را به عمق محیط فرو برده و سپس محیط در دمای ۳۷ درجه سلیسوس به مدت زمان ۲۴ ساعت گرمخانه گذاری شد.
جدول ‏۳‑۵: تفسیر محیط TSI بر اساس عمق محیط

جدول ‏۳‑۶: تقسیر محیط TSI بر اساس سطح مایل محیط