فعال سازی PKC در نورون­های هیپوکمپ باعث مهار جریان­های پتاسیمی مداوم، که شامل جریان­های پتاسیمی وابسته به کلسیم یا I_K-Ca و غیر وابسته به کلسیم I_K می­ شود(Doerner et al., 1988) ، در حالیکه در سلول­های نوروبلاست، جریان­های پتاسیمی نوع M را مهار می­ کنند (Malenka et al., 1986).
فعال­سازی PKC توسط فوربول استر یا دی­آسیل گلیسرول جریان سدیمی را در نورون­های مغز موش کاهش می­دهد (Numann et al., 1991).
فصل سوم
۳- مواد و روش­ها
۳-۱) حیوانات
مدل آزمایشگاهی مورد استفاده در کلیه آزمایش‌ها، حلزون باغی (Caucasotachea atrolabiata) بود (شکل ۳-۱). نمونه بالغ حلزون باغی، دارای صدف بزرگی با قطر تقریبی ۳ سانتی متر، راست گرد، فشرده (طول کمتر از عرض) و دارای ۴ تا ۵ پیچ در طول صدف می‌باشند. صدف در رنگ‌های مختلف و معمولا به رنگ قهوه­ای تیره یا شاه بلوطی با نوارهای زرد رنگ دیده می‌شود. نمونه‌ها در شرایط مناسب از لحاظ درجه حرارت مناسب، نور و دسترسی به آب و غذا در شرایط آزمایشگاه نگهداری و با هویج، خیار و کاهو تغذیه می­شدند.
شکل ۳-۱٫ حلزون باغی
۳-۲) تشریح و آماده سازی گانگلیون عصبی جهت ثبت
آزمایش‌ها بر روی نورون‌های مجموعه گانگلیونی تحت مری^[۴۶] انجام می‌گرفت (شکل ۳-۲). قبل از انجام آزمایش، به منظور ایجاد شرایط فیزیولوژیک یکسان و حصول اطمینان از فعال بودن جانور، آن‌ ها را درون ظرف آب قرار داده و پس از بیرون آمدن از صدف ابتدا صدف جانور بوسیله انبر استخوان شکن برداشته شده و سپس به کمک سوزن سر و پای حلزون بدون صدف روی چوب پنبه ثابت می‌شد. با ایجاد شکافی طولی در ناحیه گردن جانور، حلقه گانگلیونی دور مری شناسایی و از بدن خارج شده و به داخل محفظه‌ ثبت با بستر سیلگارد و حاوی رینگر نرمال حلزون منتقل و سپس با سوزن حشره در این محفظه تثبیت می‌شد. نورون‌ها در این مجموعه گانگلیونی بوسیله دو لایه بافت پیوندی احاطه شده‌اند. بخش پشتی گانگلیون دارای اعصاب کمتری بوده و با برداشتن لایه­ های پیوندی در این ناحیه، توسط پنس‌های بسیار ظریف در زیر استریومیکروسکوپ، نورون‌ها آشکار می‌شدند.
شکل ۳-۲٫ گانگلیون تحت مری تثبیت شده در محفظه ثبت
۳-۳) محلول‌ ها و داروها
محلول رینگر نرمال حلزون شامل (بر حسب میلی مولار):
NaCl (80)، (۱۰) CaCl₂، MgCl₂ (۵)، KCl (4)، HEPES (5) و Glocuse (10) بود (Taylor, 1987) و PH آن به کمک دستگاه PH متر و با بهره گرفتن از Trisma base در حد ۴/۷ تنظیم می‌گردید.
لینالول در یخچال نگهداری ‌شده و قبل از انجام آزمایش‌ها غلظت‌های مناسب آن تهیه و در حین انجام آزمایش غلظت­های مورد نظر به محفظه ثبت سلولی افزوده می‌شد. سایر دارو­ها شامل نیکل کلرید (مهار کننده غیر اختصاصی کانال‌های کلسیمی) و نیفدیپین^[۴۷] (مهار کننده کانال کلسیمی نوع L) و کلریترین (مهارکننده­ی پروتئین کیناز C) و H89 (مهارکننده­ی پروتئین کیناز A) می­باشند که در یخچال نگهداری و مورد استفاده قرار گرفتند.
۳-۴) ثبت داخل سلولی
پتانسیل‌های عمل خودبخودی و برانگیخته در شرایط کنترل و متعاقب تیمارهای مختلف با روش تثبیت جریان با بهره گرفتن از آمپلی فایر(npi, Germany) SEC-10LX ثبت گردید. میکروالکترودهای مورد استفاده از میکروپیپت‌های دیواره نازک از جنس بروسیلیکات (USA) و با کمک یک میکروالکترود پولر افقی (Sutter Instrument, USA) تهیه می‌شد. الکترودها با محلول KCl سه مولار پر شده و نمونه‌های بدون نشت که ۵-۱ مگا اهم مقاومت داشتند جهت ثبت مورد استفاده قرار می‌گرفتند. یک سیم نقره با روکش کلرید نقره محلول داخل میکروالکترود شیشه ­ای را به ورودی پره­آمپلی فایر وصل می‌کرد. در تمام آزمایش‌ها از یک پل آگار بعنوان الکترود مرجع استفاده می‌شد که محلول محفظه­ی ثبت را به پتانسیل صفر (زمین) وصل می‌کرد (شکل۳-۳).
پس از ورود الکترود به نورون، ثبت پایه برای حدود پنج دقیقه به عمل می‌آمد و درصورتی که نورون از نظر ویژگی‌های الکتریکی غشاء دارای وضعیت مناسب و پایدار بود، ثبت پتانسیل‌های غشائی در وضعیت تثبیت جریان در شرایط کنترل و متعاقب تیمارهای مختلف به عمل می‌آمد. داده‌های ثبت شده توسط یک مبدل آنالوگ-دیجیتال HEKA, Germany)) رقمی شده و به کمک نرم افزار Patchmaster ذخیره می‌گردید و انالیز داده ­ها با نرم­افزار fitmaster انجام می­شد.

شکل ۳-۳٫ نمایی از وسایل ثبت داخل سلولی. ولتاژ غشاء ثبت شده توسط میکروالکترود (A) به ترتیب به آمپلی فایر، مبدل آنالوگ/ دیجیتال و دیجیتال/آنالوگ (B) و نهایتاٌ به کامپیوتر © منتقل می‌شود.
۳-۵) مراحل آزمایش
ابتدا فعالیت خودبخودی و برانگیخته سلول با تکنیک کلمپ جریان ثبت می‌شد. پس از انجام این ثبت در هر گروه داروهای مورد نظر به محیط خارج سلولی تزریق شده و مجدداٌ در محلول جدید، فعالیت خودبخودی و برانگیخته ثبت می‌شد.
جهت بررسی و مطالعه فعالیت خودبخودی نورون‌ها در شرایط کنترل ابتدا به مدت ۵ دقیقه ثبت پایه در رینگر نرمال بعمل می‌آمد و فرکانس و ویژگی‌های اسپایک‌های خودبخودی نورون‌ها ثبت می‌شد. سپس به منظور بررسی اثر مستقیم لینالول بر فعالیت الکتریکی سلول و نقش احتمالی آن در تحریک‌پذیری نورونی، این ماده با غلظت‌های۱/۰ و ۲/۰ میلی مولار به محفظه‌ی ثبت داخل سلولی افزوده می‌شد و همانند شرایط کنترل فعالیت خودبخودی و برانگیخته مورد مطالعه قرار می‌گرفت.
به منظور بررسی نقش کانال­های کلسیمی در رابطه با عملکرد لینالول، از مهار کننده‌های این کانال‌ها یعنی نیکل کلرید (مهار کننده غیر اختصاصی کانال‌های کلسیمی) و نیفدیپین^[۴۸] (مهار کننده کانال کلسیمی نوع L) و به منظور بررسی نقش کیناز­ها از کلریترین (مهارکننده­ی پروتئین کیناز C) و H89 (مهارکننده­ی پروتئین کیناز A) استفاده شد.
۳-۶) پارامترهای الکتروفیزیولوژیک مورد مطالعه
پارامترهای الکتروفیزیولوژیک مورد بررسی در این مطالعه از قرار زیر می‌باشند:
پتانسیل استراحت غشاء (RMP)
آستانه پتانسیل عمل (Threshold)
فرکانس فعالیت الکتریکی خودبخودی
طول مدت پتانسیل عمل در پتانسیل آستانه (Action potential duration)
طول مدت فاصله بین پتانسیل عمل­ها (Interspike interval)
سطح زیر منحنی پتانسیل عمل (Integral)
دامنه‌ی پتانسیل عمل (AP amplitude)
دامنه ولتاژ پتانسیل متعاقب هیپرپلاریزان (AHP^[49])
طول مدت دوره AHP (AHP Duration)
شیب فاز دپلاریزاسیون و رپلاریزاسیون پتانسیل عمل (D slope& Rslope)
فرکانس پتانسیل عمل در حین تزریق جریان مثبت
دوره مهار فعالیت متعاقب تحریک^[۵۰](PSIP)
مقاومت ورودی سلول (input resistance)
شکل ۳-۴٫ نحوه اندازه گیری برخی پارامترهای پتانسیل عمل
۳-۷) آزمون آماری
اندازه ­گیری پارامترهای مورد نظر فعالیت­های الکتریکی ثبت شده به کمک نرم افزار Fitmaster انجام شد و به منظور مقایسه داده‌ها از آزمون آماری Repeated measure و تست Bonferroni استفاده شد. داده‌ها به صورت Mean ± SEM گزارش شده و اختلاف‌های با ۰۵/۰P< بعنوان سطح معنی­داری در نظر گرفته شدند.
فصل چهارم
نتایج
۴-نتایج
۴-۱) ویژگی‌های فعالیت خودبخودی و برانگیخته نورون‌های حلزون در شرایط کنترل
نورون‌های گانگلیون تحت مری حلزون در رینگر نرمال دارای میانگین پتانسیل استراحت mV 16/2±۶۵/۴۲- و فعالیت ریتمیک خودبخودی منظم با میانگین فرکانس Hz 37/0±۴۷/۲ بودند. میانگین طول مدت پتانسیل عمل در آستانه‌ پتانسیل عمل ms 96/2±۰۷/۱۵و متوسط فاصله بین دو پتانسیل عمل s 057/0±۴۵۵/۰ بود. دامنه و سطح زیر منحنی پتانسیل عمل بترتیب mV 54/3±۲۰/۷۲ و μVs 72/78±۷۶/۳۷۳ بود. پتانسیل‌های متعاقب هیپرپلاریزاسیون (AHP)، دامنه‌ای در حدود mV 58/0±۵۲/۶- داشتند و متوسط طول مدت این پتانسیل‌های متعاقب s 015/0±۰۹۷/۰ بود. متوسط شیب فاز دپلاریزاسیون و شیب فاز رپلاریزاسیون پتانسیل عمل بترتیب mV/ms 77/1±۰۴/۱۳ و mV/ms 13/1±۳۰/۶- بود.
۴-۲) اثرات غلظت‌های ۱/۰ و ۲/۰ میلی مولار لینالول بر ویژگی‌های الکتروفیزیولوژیک نورون‌های حلزون
۴-۲-۱) ویژگی‌های پتانسیل عمل خودبخودی در حضور لینالول ۱/۰ میلی­مولار
درحضور غلظت­های ۱/۰ میلی مولار لینالول در محلول خارج سلولی پتانسیل استراحت طی ۵ و ۱۰ دقیقه افزایش یافت و این تأثیر از نظر آماری بین دو زمان ۵ و ۱۰ دقیقه و کنترل به ترتیب با ۰۵/۰ P< و۰۱/۰ P< معنی­دار بود. فرکانس پتانسیل‌های عمل طی ۵ و ۱۰ دقیقه پس از کاربرد لینالول افزایش یافت که این افزایش بین زمان­های ۵ و ۱۰ دقیقه و کنترل با ۰۵/۰ P< معنی‌دار بود (شکل ۴-۱ و نمودار ۴-۱).
نمودار ۴-۱٫ نمودار مقایسه میانگین پتانسیل استراحت غشاء (A) و فرکانس پتانسیل عمل (B) در شرایط کنترل و در ۵ و ۱۰ دقیقه پس از افزودن غلظت ۱/۰ میلی مولار لینالول به رینگر حلزونی نرمال (۸₌n). 05/0 P<^*و ۰۱/۰ P<^** در مقایسه با کنترل.