به منظور بررسی ریزازدیادی ختمی چینی در شرای درونشیشهای، سه آزمایش بهه صهورت طهرح کهاملا تصهادفی بها 10 تکهرار ، در آزمایشگاه کشت بافت دانشکده کشاورزی دانشگاه شهید چمران اهواز در سال 1393 انجام گرفت. در آزمایش اول محی پایه مناسهبمشخص شد. آزمایش دوم بهترین غلظت هورمون BAP جهت القای شاخه و آزمایش سوم بهترین نوع و غلظت هورمهون ریشههزایهیمشخص شد. مقایسه میانگین آزمایش اول نشان داد که بیشترین میانگین طول شاخساره، تعداد برگ، وزن تر و وزن خشه شاخسهارهدر محی VS نسبت به سایر محی ها مشاهده شد. مقایسه میانگین آزمایش دوم نشان داد که غلظت 5/0 میلیگرم بر لیتر هورمون BAP بیشترین میانگین طول شاخساره، تعداد برگ، وزن تر و وزن خش شاخساره نسبت به سهایر غلظهتهها را داشهت. مقایسهه میهانگینآزمایش سوم نشان داد که غلظت 2/0 میلیگرم در لیتر هورمون IBA بیشترین میانگین درصد ریشهزایهی، تعهداد ریشهه و طهول ریشههنسبت به سایر غلظتها را داشت.
کلید واژه ها: بنزیل آمینوپورین، پزآوری، ختمی چینی، ریشهزایی، محی VS
Email: mousa_mousawi@yahoo.com نویسنده مسئول *
مقدمه
ختمی چینهی )بها نهام علمهیHibiscus rosa sinensis ( از شاخه گیاهان گلدار، زیرشاخه نهانهدانگان، رده دولپههایهها،راسته پنیرکسانان، تیره پنیرکیهان و سهرده ختمهی اسهت کههاولین بار به نام کارل فن لینه نامگذاری شده است ]9[. تکثیر ختمی چینی از طریق رویشی ی تکنیه عمهده بهه شهمارمیرود، اما سالم بودن و عاری بودن گیاهان از بیمهاری قابهلاطمینان نیست. تکنی کشت بافت ی روش مناسهب بهرایتکثیر سریع گیاهان عاری از ویروس است] 23[.
روش کشت بافت دارای مزایای زیادی است، زیهرا امکهان رشد سریع و تولید باکیفیت بالای گیاههان را مهی دههد و ابهزار مناسبی برای رسیدن به اهدافی است که در شهرای کشهت در محهی طبیعهی دسهتیابی بهه آنها دشهوار مهی باشهد. امهروزهریزازدیادی یکی از مهمترین بخشهای زیست فناوری گیهاهیاست که جنبه کاربردی و تجاری پیدا کرده است] 14[.
یکی از مهمترین مراحهل ریزازدیهادی مرحلهه پهرآوریشاخه است، زیرا تهیه شاخسارههای مناسهب بهرای ریشهه-زایی از ریزنمونهها برای تکثیر انبوه از این مرحله آغاز می-شود. سرعت پرآوری متأثر از تنظیمکنندهههای گیهاهی بهه-خصو سایتوکینینها مهی باشهد. حضهور سهایتوکینین بههپرآوری نمونه ها در محی کشت کم میکند] 11[. تنظیمکنندههای رشد و ترکیبات محی کشت، عوامل کلیدی برای تکثیر در شیشه و باززایی هستند ]8[. سهیتوکینین هها نقهش بسیار مهمی در رشد و تمایز بافتها دارند و باع توسهعه سلول میشوند. سیتوکینینها در تقسیم یاختهه هها در بافهت -های گیاهی نقش کلیدی داشته به گونهای که تقسیم یاختهه را از طریق تأثیر بر عواملی که عبور یاخته از چرخه تقسهیم یاختهای را مهار میکنند، کنتهرل مهی نمایهد. ایهن هورمهون علاوه بر آنکه سرعت تقسیم را تنظیم میکند، رشد جوانهه –های جانبی را نیز تحری مینماید. سیتوکینینها در غلظت ک م) 1/0 میل یگ رم در لیت ر( باع تولی د ک الوس و در غلظت های بیشهتر ) 10-1 میلهی گهرم در لیتهر( شهاخهزایهی را تحری مینمایند] 14[. بنزیل آمینو پورین) BAP( تنظیمکننهدهرشدی است که بیش از سایر سایتوکینینها در کشت بافت مورد استفاده قرار میگیرد. هورمون BAP مؤثرترین تنظیم کننهده رشهددر تحری پرآوری شهاخه اسهت] 26[. سهیتوکینین ههایی نظیهربنزیل آمینوپورین با تحری تقسیم سلولی باع رشد و شهاخه -زایی بهتر در ریزنمونهها میشود] 12[.
ریشهزایی ریزقلمهها در کشت درونشیشهه ای یکهی ازملاکهای موفقیت در ریزازدیادی هر گیاه محسهوب مهی-شود. ریشهزایی توس عوامل مختلفی نظیهر وجهود تنظهیم -کنندههای رشد در محی، ترکیب نم های پایه، ژنوتیپ و شرای کشت کنترل میشود. برای بیشهتر گونهه هها ، وجهود اکسین برای انگیزش ریشهزایی لازم است. نسبت اکسین به سیتوکینین جهت القاء و رشد ریشه مهم میباشد با افهزایش اکسین و کاهش سیتوکینین، ریشه ها تشهکیل مهی شهوند ] 4[.
هدف از انجام پژوهش حاضهر، تهیهه دسهتورالعملی بهینههجهههت تکثیههر درختچههه ختمههی چینههی در شههرای درونشیشه ای می باشد.
مواد و روشها
به منظور ریزازدیادی ختمی چینی، پژوهشی در سه آزمایش مجهزا در قالهب طهرح کهاملا تصهادفی در 10 تکهرار ، در آزمایشگاه کشت بافت دانشکده کشاورزی دانشهگاه شههید چمران در سال 94-1393 انجام شد.
آزمایش اول: بررسی نوع محیط پایه مناسب
برای انجام این آزمایش از محی کشته هایVS ،MS و WPM محتوی 5/0 میکرومولار بنزیل آمینو پورین) BAP(، 30 گهرم درلیتهر سهاکارز و س ه گ رم در لیت ر ژل رای ت جه ت پ رآوری ریزنمونه ههای ختمهی چینهی اسهتفاده گردیهد. پهس از 4 هفتههش اخصه ای رش دی م وردنظر )ش امل تع داد ب رگ، ط ول
شاخساره، وزن تر و وزن خش شاخساره( اندازهگیری شدند. آزمایش دوم: بررسی اثتر هورمتونBAP بتر پترآوریشاخساره
برای انجام ایهن آزمهایش، از محهی کشهتVS بها چههارغلظت متفاوت از هورمون BAP )0، 25/0، 5/0 و 1 میلی–گرم در لیتر( جهت پرآوری ختمی چینی استفاده شد. پهساز 21 روز ش اخصه ای رش دی م وردنظر )ش امل ط ول شاخساره، تعداد برگ، وزن تهر و وزن خشه شاخسهاره(اندازهگیری شدند.
آزمایش سوم: بررسی اثر هورمونهای ریشهزایی برای انجام ایهن آزمهایش از محهی کشهتVS 2/1 بها سههغلظت متفهاوت از هورمهونهها )شهامل شهاهد،NAA 1/0، IBA ،0/1IBA ،0/4NAA ،0/2NAA2/0 و IBA4/0 میلیگرم بر لیتر( جهت ریشهزایی ختمی چینی استفاده شد .
پس از 21 روز شاخصههای رشهدی مهورد نظهر )درصهدریشه زایی، تعداد ریشه و طول ریشه( اندازهگیری شدند .
برای هر سه آزمایش، ریزنمونههای مورد استفاده شامل قطعات ته گهره ای )نهودال سهیگمنت[1]( بهه طهول 2-5/1 سانتیمتر بودند. مراحل ضدعفونی شامل اسهتفاده از اتهانهل70 درصد به مدت 30 ثانیه، هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد به مدت 15 دقیقه و 3 بار آبشویی با آب مقطر اسهتریل بههمههدت 5 دقیقههه بههوده اسههت. تمههام مراحههل ضههدعفونیریزنمونه ها زیر هود لامینار انجام گردید.
پس از آمهاده سهازی محهی ههای غهذایی ههر کهدام ازآزمایشهای فوق ،pH آنها بهر روی 7/5 تنظهیم گردیهد وپس از اضافه نمودن آگار به وسیله اتهوکلاو در دمهای 121 درجه سانتیگراد و فشار psi15 ضدعفونی شهدند. شهرای آنکوباسیون مورد استفاده جهت نگهداری کشته ها در ههرس ه آزم ایش دم ای 1 ± 25 و 16 س اعت روش نایی و 8 ساعت تاریکی بود.
نتایج و بحث آزمایش اول: نوع محیط پایه
نتایج تجزیه واریانس آزمایش اول نشان داد که نوع محهی پایه بر شاخصهای طهول شاخسهاره، تعهداد بهرگ و وزنخش در سطح 1 درصد معنیدار بود و شهاخص وزن تهردر سطح 5 درصد معنیدار بود )جدول 1(. جدول مقایسههمیانگینها نشان داد که حداکثر طول شاخساره، تعداد برگ ،وزن تر و وزن خش مربوط به محهی VS و کمتهرین آندر محی WPM مشاهده شد )جدول 2(.
جدول 1 . نتایج تجزیه واریانس آزمایش نوع محیط پایه مناسب ریزازدیادی ختمی چینی1
منبع تغییرات درجه آزادی طول شاخساره تعداد برگ میانگین مربعات وزن تر وزن خش نوع محی پایه 2 **246/4 **18/24 *722/0 **015/0
خطا 24 524/0 49/2 131/0 002/0 ضریب تغییرات(%) 1/43/344/3
** – معنیدار در سطح 1 درصد
* – معنیدار در سطح 5 درصد ns – عدم معنیداری
جدول 2 . مقایسه میانگین آزمایش انواع محیط پایه
وزن خش
وزن تر
تعداد برگ
طول شاخساره
محی کشت
0/199a
1/307a
7/20a
2/776a
VS
0/114b
0/799b
3/532b
1/422b
MS
0/099b
0/562b
3/264b
1/016b
WPM
میانگینهای با حروف مشابه در هر ستون برای هر عامل اختلاف معنیداری ندارند.
شکل 1. ریزنمونههای ختمی چینی در محیط کشتهای مختلف
بهترین نوع محی پایه بر پرآوری گیاهچه ختمی چینی به محی MS( VS حاوی کلات آهن FeEDDHA( تعلهقیافت، بهطوریکه محی VS باع افهزایش معنهیداری در طول شاخساره، تعداد بهرگ، وزن تهر و وزن خشه شهد.
نتایج این آزمایش با تحقیقات] 6[ روی ختمی چینی] ،25[ روی رز] ،13[ روی رز] ،19[ روی ب ادام تل خ و] 3[ روی رز مطابقت دارد. دلایل متعددی بهرای مهؤثرتر واقهع بهودن
کلات آهن FeEDDHA نسبت به کهلات آههنFeEDTA در محی کشت MS بر بهبود شهاخص ههای رشهدی گیهاهوجود دارد که در ادامه به آنها اشاره خواهد شهد ] 16[. در زمینه خصوصیات لازم برای مؤثر بودن کهلات هها گهزارشکرد که تأثیر کلاتها بهه وسهیله توانهایی بقهاء در محلهولخ اک، توان ایی رقاب ت ب ا ک اتیونه ای دیگ ر و توان ایی آزادسازی و انتقال آهن به گیاه تعیین میشوند.
بسیاری از فرمولهای استاندارد محی کشت بافت، حاوی FeEDTA به عنوان منبع آهن هسهتند و حساسهیت ایهن نهوعکلات آهن به نور، سبب جایگزین کردن این نوع کلات آههن با منابع آهن دیگر در بسیاری از گیاهان حساس به کلروز آههن
ش ده اس ت. در بررس ی ت أثیر ک لات آه ن FeEDDHA در مقایسه با کلات آهن FeEDTA گزارش دادند که تثبیت آههندر کلات آهن FeEDTA به دلیل جهایگزینی بها 2+Ca و 2+Zn آن کمتر است و به سرعت رسهوب مهیشهود در مقابهل آههنموجود در کلات آهن FeEDDHA به دلیل ثبهات و اسهتحکامکلات از رسوب آهن حتهی زمهانیکههpH بیشهتر از 9 باشهد،جلوگیری میکند. جذب آهن در ریزنمونههایی کهه در تمهاسبا محی کشت هستند، نسبتا به آرامی رخ مهی دههد ] 1 و 15[.
بنابراین استفاده از شکلهای پایدار آههن بهرای گیاههان باعه رشد بهتر آنها میشود.
نور تغییراتی را درFeEDTA ایجاد میکند که موجهبکاهش قابلیت دسترسی آهن و تخریهبIAA مهی شهود، ازآنجاییکه FeEDTA ترکیبهی اسهت کهه در محهی کشهتبافت نور را جذب میکند، بیشترین احتمال این اسهت کههموجب تخریب اکسین شود] 5[. شاخسارهها در محی های حاویFeEDDHA قدرت رشد رویش جوانههای بیشتری را نشان دادند. قدرت رویش جوانهها، رابطهه مسهتقیمی بهاتغذیه مطلوب ریزمغذیها بهخصو نوع کلات آهن دارد که میتواند بیانگر جهذب بهتهر آههن و نقهش مهؤثر آن درساختمان کلروفیل و فتوسهنتز بهتهر، در ایهن شاخسهارهههاباشد.
نتایج تحقیقهات بهر روی ختمهی چینهی نشهان داد کههبالاترین میانگین طول شاخه، تعداد برگ، وزن تر و خش شاخه، میزان کلروفیل و تعداد شاخسهاره در محهی کشهتMS همراه با VS( FeEDDHA( در مقایسه با MS همراه با FeEDTA بهدست آمد] 6[. بهترین محی پرآوری برای رز محی VS نسبت به محی ههایMS و WPM اسهت، بهه–طوریکه بیشترین تعداد شاخه و ارتفهاع شهاخه در محهی کشت VS بهدست آمهد و کمتهرین مقهدار تعهداد شهاخه وارتفاع شاخه در محهی کشهتWPM بهه دسهت آمهد] 3[.
نتایج دیگر تحقیقات، محی VS را در تمهام شهاخصههایمورد ارزیابی در آزمایش بهترین محی نسبت به محی های MS و WPM نشان داد و به دلیل بالاتر بودن قدرت یهونیدر محهی کشهتWPM نسهبت بهه محهی ههایMS و VSکمترین مقدار در تمام شاخصها مربوط به ایهن محهی کشت بود] 13[.
بنابراین باتوجه به موارد فوق کلات آههنFeEDDHA توانسته با افزایش میزان حلالیت آهن در محی رشهد گ یهاهدر شرای درونشیشهای میزان بیشتری آهن در اختیار گیهاهق رار داده و مس لما ب ا ف راهم ش دن آه ن م ورد نی از در ساختمان کلروفیل، باع بهبود شاخصههای رویشهی رشهدشده اسهت زیهرا آههن در فراینهد فتوسهنتز در واکهنشههایاکسیداسیونی و احیاء بهواسطه حضور پهروتئین ههای حهاویآن از قبیل سیتوکرومها و فرودوکسینهها نقهش دارد. در اثهرکمبود آهن، انتقال الکترون فتوسنتزی کاهش یافته که این امر موجب کاهش تثبیت دیاکسیدکربن و کاهش غلظت نشاسته و کربوهیدراتهای محلهول در گیاههان در طهی دوره رشهدرویشی شده و از این طریق موجهب کهم شهدن تولیهد مهادهخش گیاهی یا کاهش رشد سبزینهای گیاه میشود] 17[.
آزمایش دوم: شاخهزایی
نتایج تجزیه واریانس آزمایش دوم نشان داد که غلظتهای مختلف BAP بر شاخصهای طول شاخساره، تعداد بهرگ،وزن تهر و وزن خشه در سهطح 1 درصهد معنهیدار بهود)جدول 3(. مقایسه میانگینها نشان داد که بهالات رین طهولشاخساره مربوط به غلظت 5/0 میلیگهرم بهر لیتهرBAP و کمترین آن مربوط به شاهد مشاهده شهد )جهدول 4(. بهینغلظتهای صفر و 25/0 میلیگرم بهر لیتهرBAP از لحها آماری اختلاف معنیداری مشهاهده نشهد. بیشهترین تعهدادبرگ مربهوط بهه غلظهت 5/0 میلهی گهرم بهر لیتهرBAP بهامیانگین 91/4 برگ به ازای ریزنمونه و کمترین آن مربهوطبه شاهد با میانگین 1/2 برگ به ازای ریزنمونه مشاهده شد .بین غلظتهای صهفر و 25/0 میلهی گهرم بهر لیتهرBAP از لحا آماری اختلاف معنهی داری مشهاهده نشهد. بیشهترینوزن تر مربوط به غلظت 5/0 میلهی گهرم بهر لیتهرBAP بهامیانگین 394/0 و کمترین آن مربوط بهه غلظهت شهاهد بهامیانگین 074/0 گرم مشاهده شد. بین غلظهت ههای 25/0 و ی میلیگرم بر لیتر BAP از لحا آماری اختلاف معنهی –داری مشاهده نشد. بیشترین وزن خش مربوط به غلظهت5/0 میلیگرم بر لیتر BAP با میانگین 047/0 و کمتهرین آنمربوط به غلظت شاهد با میانگین 007/0 گرم مشاهده شد .بین غلظتهای صهفر و 25/0 میلهی گهرم بهر لیتهرBAP از لحا آماری اختلاف معنیداری مشاهده نشد.
جدول 3 . نتایج تجزیه واریانس آزمایش اثر غلظتهای مختلف BAP بر روی شاخهزایی ختمی چینی
منبع تغییرات درجه آزادی
طول شاخساره تعداد برگ وزن تر وزن خش
0/0041**
0/18182**
17/299** 16/7582** 3
غلظت BAP
0/00013
0/0032
0/2765 0/2055 36
خطا
5/4
2/6
1/6 1/5
ضریب تغییرات%) (
جدول 4 . مقایسه میانگین آزمایش شاخهزایی ختمی چینی
** – معنیدار در سطح 1 درصد
* – معنیدار در سطح 5 درصد ns – عدم معنیداری
وزن خش
وزن تر
تعداد برگ
طول شاخساره
لظتهای مختلف BAP
0/0035c
0/074c
2/1c
1/73c
0
0/0073c
0/165b
2/22c
1/86c
0/25
0/047a
0/394a
4/91a
4/41a
0/5
0/027b
0/218b
3/51b
3/45b
1
میانگینهای با حروف مشابه در هر ستون برای هر عامل اختلاف معنیداری ندارند.
شکل 2 . ریزنمونههای کشت شده در غلظتهای مختلف هورمون BAP از بالا به پایین بهترتیب غلظتهای 5/0، 1، 25/0 و 0 میلیگرم بر لیتر
مرحله ریزازدیادی با مرحله پرآوری شکل میگیرد، زیهراتهیه شاخسارههای مناسب برای ریشهزایی از این ریزنمونهها بوده و تکثیر انبوه ریزنمونهها از این مرحلهه آغهاز مهیشهود.سرعت پرآوری متأثر از تنظیمکنندههای گیاهی بهه خصهو سایتوکینینها بهوده اسهت. حضهور سهایتوکینین بهه پهرآورینمونهها در محی کشت کم میکند] 20[. هورمهونBAP مؤثرترین تنظیمکننده رشد در تحری پرآوری شهاخه اسهت]26[. سیتوکینینههای نظیهر بنزیهل آمینوپهورین بها تحریه تقسیم سلولی باع رشد و شاخهزایی بهتهر در ریزنمونههههامیشود] 12[. سیتوکینینهها در غلظهت بهالا سهبب تحریه تولید ساقههای نابهجا می شوند و غالبیهت انتههایی را حهذفمههیکننههد. البتههه کههاربرد مقههادیر بههالای آن سههبب ایجههاد ناهنجاری های ژنتیکی در بافهت هها مهیشهود. سهیتوکینینههانقشهای متعددی در کنترل نمهو گیهاه بهازی مهیکننهد و درتحری مستقیم یها غیرمسهتقیم ابتهدای شهاخه بسهیار مهؤثرهستند. به هرحال، مکانیسم عمل آنها در سهطح مولکهولیمشخص نیست. در اغلب شرای سنتز RNA را فعال کرده و سنتز پروتئینها را تحری میکنند و اغلب آنزیمهها را فعهالمیکنند. سایتوکینینها همراه با اکسهین هها در تنظهیم چرخههسلولی در سلولهای گیاهان شرکت میکنند. سهایتوکینین ههااحتمالا سیکلین نوع D3( D( را تحری مهی کننهد و بنهابراینپیشرفت چرخه سلولی از 1G به S انگیخته میشود و احتمالا انتق ال از 2G ب ه M ب ا تحری بی ان ژن 2CDC ب هواس طه هیستون 1H کیناز و تحریه دفسفوریلاسهیون آن بههوسهیله25Cdc صورت میگیرد. در غیاب آنها مرحله متافاز میتوز به طور قابل ملاحظهای طولانی میشود] 10[.
آزمایش سوم: ریشهزایی
نتایج تجزیه واریانس آزمایش سوم نشان داد کهه غلظهتههایمختلف هورمونهای ریشهزایی بر شاخصهای درصد ریشهه -زایی، طول ریشه و تعداد ریشهه در سهطح 1 درصهد معنهیدار بود )جدول 5(. مقایسه میهانگین ههای نشهان داد کهه بیشهتریندرصد ریشهزایی مربهوط بهه غلظهت 2/0 میلهی گهرم بهر لیتهرهورمون IBA با میانگین 100 و کمترین آن مربهوط بهه شهاهدبا میانگین 33 درصد مشاهده شد )جدول 6(. بین غلظتههای4/0 میلیگرم بر لیتر IBA بها 2/0 میلهی گهرم بهر لیتهرNAA و همچنین 4/0 میلیگرم بر لیتر NAA و شاهد از لحها آمهاریاختلاف معنیداری مشاهده نشد. بیشترین طول ریشهه مربهوطبه غلظت 2/0 میلهی گهرم بهر لیتهر هورمهونIBA بها میهانگین86/10 و کمتههرین آن مربههوط بههه شههاهد بهها میههانگین 55/1 سانتی متر مشاهده شد. بین غلظتهای 4/0 و 1/0 میلیگرم بهرلیتر IBA با 1/0 میلیگرم بر لیتر NAA و همچنهین 4/0 و 2/0 میلیگرم بر لیتهرNAA از لحها آمهاری اخهتلاف معنهیداری مشاهده نشد. بیشهترین تعهداد ریشهه مربهوط بهه غلظهت 2/0 میلیگرم بر لیتر هورمون IBA با میهانگین 8/60 و کمتهرین آنمربوط بهه شهاهد بها میهانگین 38/1 عهدد مشهاهده شهد. بهینغلظتهای 1/0 میلیگرم بر لیتر IBA با 1/0 میلیگرم بهر لیتهرNAA از لحا آماری اختلاف معنیداری مشاهده نشد.
جدول 5 . نتایج تجزیه واریانس آزمایش ریشهزایی ختمی چینی در شرایط درونشیشهای
درصد ریشهزایی طول ریشه تعداد ریشه
3009/24**
103/41**
5917/21**
6
هورمون
9/68
0/242
164/72
63
خطا
8/8
8/1
2/2
ضریب تغییرات%) (
* – معنیدار در سطح 5 درصد ** – معنیدار در سطح 1 درصد ns – عدم معنیداری
جدول 6 . مقایسه میانگین آزمایش ریشهزایی ختمی چینی در شرایط درونشیشهای
