s 30

۹۵

واسرشته سازی

s 30

۶۳و۶۱

اتصال

min 2

۷۲

طویل شدن

۱

min 10

۷۲

طویل شدن نهایی

الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره‏ای پلیمراز
به منظور بررسی محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز، مقدار۵ مایکرولیتر از محصول واکنش به همراه ۱ مایکرولیتر بافر بارگذاری ۶X مخلوط و به مدت ۹۰ دقیقه با ولتاژ ۱۰۰ ولت بر روی ژل آگارز (پیوست۵-۱-۳) الکتروفورز شد.
خالص‏سازی محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز
به جهت حصول خلوص بالا از محصول حاصل از واکنش مذکور، این عمل را به کمک کیت خالص سازی محصول واکنش PCR تهیه شده از شرکت Bioneer و براساس دستورالعمل شرکت سازنده به جهت ایجاد شرایط مطلوب عمل آنزیم‏های برشی صورت پذیرفت (پیوست۷-۱).
جداسازی محصول PCR و یا محصول حاصل از هضم آنزیمی از روی ژل آگارز
برای بردن نمونه DNA موردنظر حاصل از واکنش هضم آنزیمی (فرآورده واکنش زنجیره‏ای پلیمراز یا پلاسمید) روی ژل آگارز باید به حجم نهایی نمونه و ظرفیت چاهک توجه کرد، زیرا قطعه‏ای از ژل که جهت جداسازی وخالص‏سازی DNA جدا می‏شود نباید بیشتر از ۱۰۰ میلی‏گرم وزن داشته باشد. زیرا در غیر این‏صورت این عمل به خوبی انجام نخواهد شد. در فرایند خالص‏سازی سعی می‏شود، کوچکترین قطعه ژل که حاوی غلظت زیادی از قطعات DNA مربوطه می‏باشد، جدا شود. غلظت DNA پس از واکنش هضم آنزیمی بسیار تاثیرگذار خواهد بود چرا که اگر غلظت اولیه محصول بالا باشد، درصد بازیابی نیز به طبع آن بالاتر خواهد بود.

پس از بردن محصول واکنش هضم آنزیمی روی ژل آگارز و انجام الکتروفورز، ژل به زیر دستگاه uv منتقل شده و محدوده بالا و پایین باند مورد نظر روی ژل توسط اسکالپل تیز و تمیز، با روشن کردن لحظه‏ای uv به سرعت برش زده شده و پس از خاموش شدن uv، قطعه‏ی مورد نظر از روی ژل جدا می‏شود. باید سعی شود که در کوتاهترین زمان ممکن، قطعه مورد نظر را زیرuv برش زده وuv را به‏سرعت خاموش کرد. درعین حال باید توجه شود که تنها قطعه‏ای از ژل که حاوی باند مورد نظر است، جدا گردد و از بریدن ژل اضافی اجتناب شود.
قطعه جدا شده از ژل که حاوی DNA مورد نظر می‏باشد را داخل یک تیوب ۵/۱ میلی‏لیتری استریل قرار داده و سپس بعد از توزین آن، مراحل خالص‏سازی با بهره گرفتن از کیت بازیابی قطعات DNA از ژل آگارز شرکت Bioneer و مطابق روشی که در پیوست (۷-۱) آمده است، انجام گرفت.
هضم آنزیمی با آنزیم‏های محدود کننده تیپ II
غلظت فراورده تکثیر شده یا پلاسمید مورد نظر جهت انجام واکنش هضم آنزیمی با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفوتومتر و یا با بردن ۵ مایکرولیتر از آن بر روی ژل آگارز ۱ درصد در کنار مارکر تعیین غلظت لامبدا یا نشانگر وزن مولکولی تعیین می‏گردد. واکنش هضم آنزیمی برای دو گروه محصول، یکی محصول حاصل از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با Pfu و دیگری محصول واکنش هضم آنزیمی DNA پلاسمیدی به ترتیب، در حجم‏های ۳۰ تا ۵۰ و ۲۰-۳۰ مایکرولیتری انجام گرفت. در اکثر موارد واکنش های هضم به مدت ۴-۳ ساعت در بن‏ماری با دمای ۳۷ درجه سانتی‏گراد انجام گرفت و پس از آن جهت مشاهده باندهای موردنظر و تایید اندازه باند مورد نظر بر روی ژل آگارز ۱% برده شدند. جهت تایید ناقل کلونینگ، واکنش تک هضم آنزیمی، آنزیم‏های برشی XbaI ، SacI برای pGEM و همچنین BamHI و XbaI برای pUC19 در کنار هضم دوتایی با آنزیم‏های مذکور انجام گرفت (جدول های۱۰-۲و۱۱-۲).
جهت تایید ناقل بیانی، واکنش تک هضم آنزیمی، آنزیم های برشی BamHI، XbaI، SacI و هضم دوتایی با آنزیم های برشی (XbaI, SacI)، (XbaI, BamHI) و (SacI, BamHI) طبق شرایط مندرج در جدول (۱۲-۲) انجام شد. فراورده تکثیر و تخلیص شده ژن‏های hrpG وhrpW و ناقل‏های کلونینگ مربوطه طبق جدول (۱۳-۲) و ناقل بیانی طبق جدول(۱۴-۲) با آنزیم‏های XbaI, SacI و XbaI, BamHI هضم شدند. همچنین این عمل با آنزیم‏های مذکور جهت تایید همسانه‏سازی در ناقل‏های کلونینگ و ناقل بیانی نیز انجام شد.
جدول۷-۲- شرایط واکنش هضم ژن hrpW و ناقل کلونینگ مربوطه(pGEM7zf(-)).

اجزای واکنش ژن hrpW ناقل کلونینگ pGEM7zf(-)

محصول PCR/ pGEM7zf(-) µl10،( ng/µl50-40) µl10(ng/µl100-80)

بافرTango X 10 µl3 ،(x1) µl2
آب دوبار تقطیر تا حجم، µl30 تا حجم، µl20
XbaI (u/µl 10) µl1 µl8/0
SacI (u/µl10) µl1 µl1

جدول۸-۲- شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل کلونینگ مربوطه(pUC19).